Работа 33. Влияние температуры на активность холинэстеразы

Влияние температуры на активность амилазы слюны

Работа 32. Влияние температуры на активность амилазы слюны

Исследуемый материал: слюна.

Реактивы: 1%-ный раствор крахмала, реактив Люголя, дистиллированная вода.

Оборудование: пипетки, пробирки, термостат, спиртовка, ледяная баня, предметные стекла.

ХОД РАБОТЫ. Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1:5) слюны. Берут первую пару пробирок (одна с ферментом, другая – с крахмалом) и помещают в баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару пробирок помещают в термостат (37˚С), а четвертую – в кипящую водяную баню. Через 5 мин. содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин при тех же условиях. Из третьей пробирки отливают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Потом добавляют по 2 капли реактива Люголя во все пробирки и наблюдают за развитием окраски.

Оформление работы. Результаты записывают в таблицу. Делают выводы о характере влияния температуры на активность амилазы.

№ пробирки	Температура инкубации, ˚С	Окрашивание с йодом

Холинэстераза – фермент, играющий существенную роль в процессе передачи возбуждения холинэргическими нервами на воспринимающие ткани. Холинэстераза расщепляет ацетилхолин – медиатор нервного возбуждения - на холин и уксусную кислоту:

(СН₃)₃ ⁺NСН₂СН₂-О-СО-СН₃ (СН₃)₃ ⁺NСН₂СН₂-О-СО-СН₃ + СН₃СООН.

В процессе реакции происходит закисление среды за счет накопления уксусной кислоты, что можно обнаружить с помощью индикатора. В работе используется двухцветный индикатор бромтимоловый синий. Зона смены окраски находится в области рН 7,6-6,0, в кислой среде окраска – желтая, в щелочной – синяя, промежуточная окраска – зеленая. Инкубацию фермента и субстрата проводят в различных температурных условиях. Об интенсивности ферментативного гидролиза ацетилхолина судят по окраске инкубационной смеси.

Исследуемый материал: сыворотка крови (разведение 1:50) – источник холинэстеразы.

Реактив: 0,5%-ный раствор ацетилхолина (готовят на дистиллированной воде,освобож-

денной от СО),0,02%-ный раствор бромтимолового синего (2,5 г сухого индикатора растирают в ступке с 4,5 мл 0,1 н раствора едкого натра, полученный раствор переносят в мерную колбу на 50 мл, добавляют 12,5 мл 0,1 н раствора борной кислоты, приготовленного на 0,1М растворе КCl, раствор доводят водой до метки, перед опытом раствор разводят водой в 2 раза).

Оборудование: пробирки, пипетки, термостат, баня со льдом.

ХОД РАБОТЫ. Берут 3 пробирки. Вносят в каждую по 2,5 мл сыворотки крови и по 0,5 мл бромтимолового синего. Одну из пробирок помещают в термостат (37˚С), вторую оставляют при комнатной температуре, третью помещают в ледяную баню. Через 5 мин, необходимых для выравнивания температуры, во все 3 пробирки вносят по 0,5 мл раствора ацетилхолина. Содержимое пробирок перемешивают и вновь оставляют в соответствующих температурных условиях. Через 10-15 мин отмечают цвет в каждой пробирке.

Оформление работы. Результаты записывают в таблицу. Делают выводы о зависимости скорости реакции от температуры.