Генная инженерия

Генная инженерия или техника рекомбинантных ДНК – совокупность приемов, позволяющих путем процессов in vitro перенести генетический материал из одного организма(источника гена) в другой(реципиент гена, хозяин гена). Используются методы и подходы биоорганической химии.

В заранее выделенный репликон хозяина in vitro вводят нужный ген из другого источника. Полученную таким способом рекомбинантную молекулу, сохраняющую все свойства репликона, снова вводят в клетку – хозяина, в которой он будет реплицироваться и стабильно передаваться клеткам-потомкам при делении. Репликоны, предназначенные для введения в клетку-хозяина, носят название векторы.

Основные химические способы введения вектора связаны с использованием ферментативных биохимических методов. Важнейшим этапов синтеза искусственных двухцепочечных фрагментов ДНК является их клонирование так, чтобы синтезированная последовательность сохранилась и могла функционировать - передавать генетическую информации о синтезе белка

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция(polymerase chain reaction PCR)- перспективная разработка в химии ДНК. Позволяет синтезировать в больших количествах отдельные участки ДНК или фрагмент нуклеотида. Эту методику используют в криминалистике, она

позволяет выделить ДНК из окаменелых остатков давно исчезнувших видов животных.

По программе HUGO (Human Genom – Геном человека) в 2000 г. был определен каждый отдельный код ДНК в генетическом материале человека.

PCR состоит в синтезе двух коротких олигонуклеотидов, точно связывающихся с концами ДНК, которые будут копироваться. Фермент ДНК-полимераза начинает сборку копий двух цепей, приводящую к получению двух новых цепей ДНК. Нагревание образца вызывает расплетание двойных спиралей и дает новые четыре цепи, которые используются для образования еще новых четырех цепей и т.д.

11.6.Метаболизм пуриновых соединений в клетке

Поступающие в организм пуриновые соединения (в составе пищи, лекарственных препаратов – аденин, гуанин, кофеин, теофиллин, теобромин) и синтезированные в организме в конечном итоге превращаются в мочевую кислоту. Азотистые основания, поступившие с пищевыми продуктами, не используются для синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот

Схема обмена азотистых оснований:

Аденин———>гипоксантин———> ксантин———>мочевая кислота

‍ ‍↑

гуанин

гипоксантин ксантин

6-оксопурин 2,6-диоксопурин

Гипоксантин и ксантин образуют изомерные лактим-лактамные формы.

Мочевая кислота (2,6,8-триоксопурин) образует двузамещенные соли, поскольку для этого соединения характерна лактим-лактамная таутомерия, сопровождающаяся образованием только двухосновной кислотной формы. Строение солей соответствует таутомерной форме 2,8-дигидрокси-6-оксопурина.

2,8 – дигидрокси - 6-оксопурин.

Атом кислорода в группе С=О в положении 6 связан водородной связью с атомом водорода N7 –Н, это препятствует переходу атома водорода от N1 –Н, что необходимо для образования полной лактимной формы.

Мочевая кислота – бесцветные кристаллы, плохо растворима в воде(0, 065 г в 100 мл при 37⁰ С), средние – двухзамещенные - соли щелочных металлов легко растворимы в воде, а кислые- однозамещенные- трудно(исключение –соли лития). Мочевая кислота, образующаяся в процессе обмена веществ, полностью выделяется из организма в составе мочи. Повышенное содержание и низкая растворимость мочевой кислоты и ее кислых солей создает угрозу кристаллизации из биологических жидкостей, мочевая кислота и соли ураты образуют камни в мочевом пузыре, почках, откладываются в суставах, закупоривают протоки слюнных и слезных желез. Такая характерная картина возникает при мочекаменной болезни и подагре.

Для проверки усвоения темы рекомендуем ответить на вопросы:

1. Соединение 6- меркаптопурин является антиметаболитом пуриновых соединений аденина и гипоксантина(в иминоформе), активно вмешивается в пуриновый обмен и блокирует синтез нуклеиновых кислот. Его применяют как антилейкемический лекарственный препарат. Запишите формулы названных пуриновых соединений. Какие химические свойства отличают между собой амино- и тиольную группы?

2. Химическое соединение 5- фторурацил (2, 4- диоксо-5- фторпиримидин) –угнетает функцию костного мозга, подавляет развитие некоторых новообразований в организме, относится к группе препаратов- антиметаболитов,

Запишите формулы трех соединений - 5-фторурацил, урацил, тимин - в двух таутомерных - лактимной и лактамной- формах. Сравните изменение кислотных свойств этих соединений в лактимных и лактамных формах..

3. Препарат 5- фторурацил обладает многими побочными токсическими

эффектами, которые уменьшаются, если соединение применять в составе N-гликозида.

Данный принцип применен при создании лекарственного соединения фторафура.

Напишите формулу N1 - нуклеозида, образованного 5-фторурацилом и моносахаридом β-D- фруктофуранозой.

4. Лекарственный препарат цитарабин (Cytarabinum) -антиметаболит пиримидиновых соединений в синтезе нуклеиновых кислот. Применяют при лечении лимфосаркомы, лейкозов. Его химическое название 1- β- D- арабинофуранозилцитозин. Составьте химическую формулу соединения.

* Помощь для выполнения задания: из названия следует, что это соединение нуклеозид, в его составе цитозин, моносахарид арабиноза (альдопентоза d d l).

5. Напишите последовательность превращений, используя структурные формулы биоорганических соединений:

АТФ ——> АДФ ——> АМФ ——> аденин + фосфат

ГТФ ——> ГДФ ——> ГМФ ——> гуанин + фосфат

6. Составьте последовательность нуклеотидов, кодирующих аминокислоту метионин

в иРНК: АUG. Какой кодон соответствует метионину в ДНК? Какой антикодон присутствует в тРНК? Напишите последовательности нуклеотидов иРНК и ДНК, используя структурные формулы.

11.7. Биологически важные соединения- мононуклеотиды, динуклеотиды- участники важнейших биохимических процессов

Уридилдифосфатглюкуроновая кислота (УДФ-глюкуроновая кислота)

В лекциях «Углеводы 1, 2» изучены строение и участие глюкуроновой кислоты в обмене веществ. Вспомним: глюкуроновая кислота входит в состав гетерополисахаридов (ГАГ), которые образуют совместно с белками внеклеточный протеогликановый матрикс соединительный ткани.

Глюкуроновая кислота участвует в обезвреживании(детоксикации) чужеродных соединений(ксенобиотиков), продуктов распада лекарственных препаратов и конечных метаболитов организма (билирубина). В этих соединениях глюкуроновая кислота образует β-гликозидную связь – β-глюкурониды.

Синтез глюкуроновой кислоты в условиях in vivo можно представить схемой:

+ АТФ изомеризация + УТФ

Глюкоза ———> гл-6-фосфат ———> гл- 1-фосфат———>

окисление

УДФ-глюкоза ———> УДФ-глюкуроновая кислота

УДФ-глюкуроновая кислота- твердое кристаллическое вещество, медленно разлагается при хранении, при Т=100 в растворе 0,01М НС1 гидролизуется в течение 15 мин.

Карбоксильная группа имеет кислотные свойства в пределах других органических карбоновых кислот(рКа =4, 4)

УДФ-глюкуроновая кислота

Реакция детоксикации - глюкуронирования ксенобиотика.

УДФ-глюкуроновая кислота + R-ОН(ксенобиотик) ———>

УДФ + гликозид глюкуроновой кислоты

Никотинамиддинуклеотид(НАД ⁺), никотинамидинуклеотидфосфат (НАДФ ⁺)

Динуклеотиды НАД ⁺,НАДФ ⁺ были открыты в исследованиях всемирно известных биохимиков О.Г. Варбурга, Г. фон Эйлера, Ф. Шленка в 1935-1936 гг. Роль коферментов НАД ⁺,НАДФ ⁺ в реакциях биологического окисления обсуждалась в лекции «Механизмы реакций биоорганических соединений», там же изучен механизм реакции гидридного переноса. в котором участвует активная часть этих молекул – никотинамид.

Коферменты НАД ⁺,НАДФ ⁺ состоят из двух нуклеотидов, образованных

никотинамидом и аденином, связанных с рибофуранозой N-β-гликозидной связью.

На атоме азота в пиридиновом цикле возникает положительный заряд, который не нарушает ароматическую систему, но увеличивает значение частичных положительных зарядов в пиридиновом цикле в положениях 2, 4, 6- по отношению к циклическому атому азота. В положении 4 пиридинового цикла происходит присоединение иона гидрида Н^– Оба нуклеотида связаны посредством ангидридной связи между двумя фосфатами – эта связь имеет характер макроэргической.

В организме человека известно более 150 ферментов оксидоредуктаз(дегидрогеназ)в составе которых находятся НАД ⁺,НАДФ ⁺. Биологические функции НАД ⁺и НАДФ ⁺ имеют отличия: роль НАД ⁺ связана в большей степени с энергетическими процессами в клетке, а НАДФ ⁺ - с реакциями пластического обмена.

Пример: Окисление молочной кислоты – фермент лактатдегидрогеназа

СН3 – СН – СООН + НАД⁺——> СН3 –С – СООН + НАДН + Н⁺

| | |

ОН О

лактат пируват

На рисунках представлены: окисленная форма кофермента НАД⁺ и восстановленная форма кофермента НАДФН.

Сравните отличия в химическом строении пиридинового цикла окисленной и восстановленных форм, отметьте положение остатка фосфорной кислоты в НАДФН (НАДФ ⁺)

кофермент НАД⁺- окисленная форма

кофермент НАДФН ^-восстановленная форма

Динуклеотиды НАД ⁺, НАДФ⁺, НАДН, НАДФН – твердые кристаллические вещества, очень гигроскопичные, хорошо растворимы в воде. НАД⁺ и НАДФ⁺ разлагаются при нагревании в воде, под действием ультрафиолета, а НАДН и НАДФН – быстрее даже при комнатной температуре. Ферментативную активность имеют соединения только с β-гликозидной связью. Имеются спектральные отличия окисленной и восстановленной форм: НАД⁺ (НАДФ⁺) λ 260 и 230 нм, НАДН(НАДФН) λ 259 и 339. на которых основано количественное определение коферментов в биологических средах и определение кинетики (скоростей) биохимических реакций. 3’-Фосфоаденозил- 5’-фосфосульфат Принимает участие в переносе сульфогруппы(из положения 5’, где между остатками фосфорной и серной кислот образуется ангидридная, макроэргическая связь). Сульфирует гетерополисахариды(ГАГ)-хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарин и ксенобиотики, которые в виде сульфоэфиров фильтруются в почке и выделяются в составе мочи из организма.

ФАФС 3’-Фосфоаденозил- 5’-фосфосульфат

Сульфирует гетерополисахариды(ГАГ) в процессе образования хондроитинсульфата, дерматансульфата, активного гепарина и ксенобиотики, которые в виде сульфоэфиров фильтруются в почке и выделяются в составе мочи из организма.

Реакция детоксикации – сульфирование ксенобиотика

R-ОН(ксенобиотик) + ФАФС ——>

3’-Фосфоаденозил- 5’-фосфат + R-О- SO3 Н