Приобретенный иммунитет

Существование у растений приобретённого иммунитета, как у теплокровных животных и человека, до недавнего времени ставилось под сомнение на том, что у них отсутствуют нервная система и кровообращение. В настоящее время факт существования приобретённого иммунитета уже не вызывает никаких сомнений. Сведения о наличии цитоплазматической связи между клетками при помощи плазмодием, проходящих через поры клеточных стенок, оказались весьма полезными в изучении этого явления. Через плазмодиями раздражение определённого участка растительной ткани распространяется практически по всем клеткам растения. Воздействие инфекции проявляется не только в клетках, непосредственно контактирующих с патогенном, но и в удалённых от места инфекции. Так, при заражении плодов цитрусовых возбудителем голубой плесени (Penicillium italicum) интен­сивность дыхания кожуры возрастает не только в очаге инфекции, но и в неинфицированных тканях, включая расположенные на противоположной стороне плода.

В зависимости от причин, вызвавших приобретенный иммуни­тет, его разделяют на инфекционный и неинфекционный. Ин­фекционный приобретенный иммунитет возникает в результате перенесенного растением заболевания, неинфек­ционный приобретенными или индуцированный, иммунитет — под влиянием внешних факторов, не приводя­щим к изменению генома растения. Факторы, воздействие кото­рых на семена или растения приводит к повышению устойчивости растений, называются индукторами. Неинфекционный при­обретенный иммунитет играет важную роль в практике сельского хозяйства и рассматривается как один из способов защиты от бо­лезней.

Приобретенный иммунитет может иметь локальный или сис­темный характер.

Локальный иммунитет проявляется вблизи места воздействия индуктора, системный — в участках, удаленных от этого места, например в других или новых листьях. Приобретенный иммунитет, как правило, неспецифичен.

Индукторы приобретенного иммунитета делят на биотические и абиотические. К первым относят грибы, бактерии, вирусы или продуцируемые ими метаболиты, ко вторым — химические веще­ства (биорегуляторы) или их смеси и физические воздействия (на­пример, облучения, температуры, магнитного поля, ультразвуко­вых колебаний и т.д.).

Индуцирование биотическими средствами проводят путем инокуляции авирулентными (непатогенными) расами, инактивированными патогенами и продуктами их метаболизма.

Индуцирование приобретенного иммунитета биотическими средствами, называемое иммунизацией, сходно с вакцинацией, широко используемой в медицине и ветеринарии.

Изучение явления иммунизации имеет длительную историю, однако в отличие от вакцинации она не нашла пока широкого практического применения в защите растений.

Вакцинация растений как способ биологической иммунизации находит применение в практике сельского хозяйства, особенно в создании приобретенного иммунитета к вирусным болезням у овощных культур — представителей семейств пасленовых (томата) и тыквенных. Заражение рассады этих культур слабыми штамма­ми некоторых вирусов приводит к появлению у растений иммуни­тета, благодаря которому они становятся устойчивыми к сильно­патогенным штаммам тех же вирусов. Этот прием получил назва­ние перекрестной защиты или интерференции.

Повышение устойчивости растений к патогену можно вызвать путем предварительного инфицирования их непатогенным изоля­том. Так, клубни картофеля, предварительно инфицированные авирулентным штаммом Ph. infestans, приобретают устойчивость к вирулентному изоляту этого гриба. В качестве вакцины могут быть использованы убитые патогены. Так, введение в ткани листьев та­бака убитой культуры Pseudomonas tabacum индуцирует устойчи­вость к этому патогену. Установлено, что в результате вакцинации в клетках растения появляются защитные вещества, например фи­тоалексины, изменяется активность ряда ферментов и появляются новые. При приобретенном иммунитете в отличие от врожденно­го защитные механизмы возникают в ответ на вакцинацию и не передаются по наследству.

Рострегулирующие бактерии, обитающие в ризосфере, могут защищать растения от грибных, бактериальных и вирусных болез­ней, индуцируя их системную устойчивость. Ризосферные микро­организмы удобны для применения в целях индуцирования устой­чивости растений к болезням. Их можно нанести на семена перед посевом или на корневую систему рассады перед посадкой путем обработки суспензией бактерий и грибов. При этом ризообитаю-щие непатогенные микроорганизмы могут выступать конкурента­ми для патогенов, колонизируя ткани растений, либо выделять метаболиты, включая те, которые обусловливают защитные реак­ции растений против патогенов. Индукционную активность на ряде культур проявляет препарат триходермин, созданный на ос­нове гриба Trichoderma lignomm.

К настоящему времени выявлено большое число синтетичес­ких и природных соединений, индуцирующих устойчивость рас­тений к болезням.

Аминокислоты и их аналоги. В культуральной жидкости биоло­гических индукторов устойчивости растений к болезням обнару­жены свободные природные аминокислоты. Наибольшей индук­ционной активностью обладает фракция, содержащая в основном глутаминовую кислоту, пролин, лейцин и аланин. Эта фракция снижала на 54 % развитие грибов рода Fusarium на проростках пшеницы (Сокирко, Вовчук, Гаврилов, 1989).

Производные карбоновых кислот. Среди производных карбо-новых кислот выявлены вещества, оказывающие влияние на ус­тойчивость растений к болезням. Среди них следует отметить салициловую кислоту, которая специфически связывается в расте­ниях с каталазой и ингибирует активность этого фермента, что со­провождается накоплением пероксида водорода— одного из ос­новных защитных веществ растений от патогенов. Она также ока­зывает влияние на уровень фитогормонов (индолилуксусной и абсцизовой кислот, а также этилена) в растениях. Индуцирующей активностью обладают и ненасыщенные высшие карбоновые кис­лоты, такие, как арахидоновая, линоленовая, линолевая, жасмо-новая, абсцизовая и полиакриловая. Арахидоновая кислота входит в состав диглицеридов, принимающих участие в установлении межклеточных контактов и передающих информацию с поверхно­сти клетки. Арахидоновая кислота стимулирует в растениях за­щитные реакции и индуцирует накопление фитоалексинов. В ма­лых концентрациях она повышает устойчивость растений карто­феля к фитофторозу. В клубнях,' обработанных арахидоновой кислотой, устойчивость к этому заболеванию развивается на вто­рые сутки и сохраняется от нескольких недель до" 2...3 мес. Она носит системный характер.

Смесевые препараты. Один из таких препаратов — хитозан, со­стоящий из глюкозаминов, индуцирует устойчивость растений риса к пирикуляриозу и ризоктониозу. К препаратам комбинаци­онного действия следует отнести четвертичные соли аммония, со­держащие в своем составе анион аминобензойной кислоты и ка­тион четвертичного аммония с гидроксиалкильной группой. Предпосевная обработка семян зерновых, овощных и некоторых других культур четвертичными солями аммония повышает устой­чивость растений к корневым гнилям, уменьшает агрессивность фитопатогенов и улучшает показатели структурных элементов урожайности на 20...25 % (Шкаликов, Хохлов, 1998).

Повышение устойчивости растений к болезням наблюдалось также после предпосевной обработки семян смесями микроэле­ментов (Кулешова, 1990). О роли микроэлементов в жизнедея­тельности растений свидетельствует тот факт, что существует целая группа болезней неинфекционного характера, которые воз­никают только в случае отсутствия или недостатка в почве каких-либо микроэлементов. Так, при недостатке в почве бора возникает гниль сердечка сахарной свеклы, развивается бактериоз льна, вы­зываемый Bacillus macerans. Неинфекционный хлороз плодовых деревьев проявляется при недостатке в почве железа. Возможность использования удобрений для повышения устойчивости растений к болезням была обоснована Т.Д. Страховым (1922). Он впервые установил, что, регулируя режим питания растений, можно изме­нить их устойчивость к тому или иному заболеванию. Он показал также, что удобрения могут повышать устойчивость злаковых культур к головневым болезням. Сходные данные были получены в многочисленных исследованиях различных сочетаний расте­ние — паразит. Механизм действия удобрений на устойчивость растений многообразен. Они оказывают существенное влияние на ход биохимических и физиологических процессов, а следователь­но, и на обмен веществ растения, изменения в котором могут ска­зываться на взаимоотношениях между растением и паразитом, в основе которых лежит приуроченность патогена к определенному типу обмена веществ растения. Чем выше паразитическая специа­лизация патогена, тем теснее взаимосвязь между обменом веществ паразита и растения-хозяина. Так, при высоком содержании азота в почве растения обычно более восприимчивы к болезням. Мно­гие облигатные паразиты (например, возбудители мучнистых рос, ржавчинных болезней и т. д.) лучше развиваются на растениях с мощной вегетативной массой. Калийные и фосфорные удобрения способствуют повышению устойчивости растений. Однако сде­лать общие выводы о влиянии удобрений на поражаемость расте­ний достаточно сложно, поскольку они могут ускорять или замед­лять рост и развитие растений, что, в свою очередь, влияет на ус­тойчивость к тому или иному патогену. Например, азотные удобрения в большинстве случаев снижают устойчивость растений к болезням, однако в отношении головневых грибов наблюдается обратная связь. Возможно, более быстрый рост растений, наблю­даемый при внесении азотных удобрений, помогает им быстрее пройти восприимчивую фазу развития. Таким образом, научно обоснованное применение как макро-, так и микроудобрений по­вышает способность растений противостоять болезни.

Защитные реакции растений изменяются при воздействии на сложившиеся между ним и паразитом взаимоотношения. Так, с помощью приемов, ускоряющих прохождение отдельных фаз раз­вития хозяина, можно сократить возможный период его зараже­ния. Например, обрезка деревьев, кустарников, подкашивание трав (клевера, люцерны) повышает устойчивость к таким приуро­ченным к периоду старения болезням, как антракноз, серая гниль и др.

Исходя из разнокачественности семян используют специаль­ные методы их отбора, позволяющие выращивать растения с по­вышенной устойчивостью. Известно, что из здоровых полновес­ных семян развиваются растения, менее восприимчивые к болез­ням. Поэтому посев семян, отсортированных по удельной массе, рекомендован как один из методов снижения поражаемости пше­ницы фузариозом или кукурузы пузырчатой головней.

В практике сельского хозяйства известно немало подобных приемов, способствующих повышению устойчивости. В большин­стве своем они основаны на знании закономерностей проявления иммунитета, что дает возможность направленного создания усло­вий, благоприятствующих проявлению у растений защитных свойств.

3. ТИПЫ ПАРАЗИТИЗМА У МИКРООРГАНИЗМОВ

Паразиты заселяют растительную ткань только в том случае, если она содержит необходимые им питательные вещества. Таким образом, паразитизм основан на пищевых взаимосвязях между па­тогеном и растением-хозяином. Что касается эволюции парази­тизма, то некоторые исследователи полагают, что паразиты расте­ний происходят от форм, ведущих сапротрофный образ жизни на стареющих растительных тканях, т. е. эволюция шла в направле­нии от облигатных сапротрофов к облигатным паразитам.

Для облигатных сапротрофов источником питательных веществ служат только мертвые органические субстраты. Фа­культативными паразитами называются организмы, ко­торые обычно живут как сапротрофы, но при определенных усло­виях могут нападать на живые ткани, в частности на старые, ос­лабленные и поврежденные или на запасающие органы. К таким паразитам относятся, например, Botrytis cinerea, Rhyzopus nigricans и др. Такие пластичные патогены часто имеют широкий круг хо­зяев, отличаются слабой специализацией и хорошо растут на ис­кусственных питательных средах. Факультативные сап­ротрофы— это организмы, которые обычно ведут паразитичес­кий образ жизни, но могут существовать и как сапротрофы. Примером таких организмов могут служить Venturia inaequalis, Phytophthora infestans и др. Они имеют более узкий круг растений-хозяев и более выраженную специализацию, в культуре растут медленно. Экологически облигатными паразитами принято считать такие патогены, которые существуют в природе как паразиты, но их можно выращивать и в культуре на искусст­венных питательных средах. К таким паразитам относят многие виды Ustilaginales. Облигатными паразитами называются организмы, например Erysiphales, Uredinales, Peronosporaceae, Albuginaceae, живущие только как паразиты.

Патогенность некоторых паразитов ослабевает при выращива­нии в аксеничной культуре. По-видимому, это объясняется тем, что в таких условиях определенные преимущества приобретают сапротрофные штаммы. Возможно также, что в основе этого явле­ния лежит адаптация. Однако часто патогенность удается восста­новить путем пассажей через восприимчивые растения.

Паразиты по-разному извлекают питательные вещества из рас­тений-хозяев. В связи с этим их можно разделить на две группы — биотрофов и некротрофов. Биотрофы извлекают необходимые им питательные вещества из живых клеток растений-хозяев, н е кротрофы — из мертвых. Как правило, облигатные паразиты не убивают восприимчивые клетки, в которые проникают: им это не выгодно, поскольку толь­ко живые клетки могут быть источником питательных веществ.

Способность патогенных микроорганизмов паразитировать на растениях обусловлена специфическими особенностями их об­мена веществ, позволяющими им преодолевать защитные меха­низмы растений-хозяев и использовать содержимое их клеток в качестве питательного субстрата. Механизм использования раз­нообразных питательных веществ варьирует у различных фито-патогенов в весьма широких пределах. Он обусловлен приспособ­ленностью этих паразитов к тому или иному виду растений, а так­же к химическому составу их клеток и анатомо-морфологическим особенностям тканей. Так, факультативным паразитам свойствен­на способность использовать широкий набор питательных ве­ществ. Они образуют множество разнообразных ферментов, кото­рые расщепляют полимерные пластические вещества растений, доводя их. до усвояемой формы. У некоторых патогенов (напри­мер, Poliporus) синтез экзоферментов (внеклеточных ферментов) значительно превышает синтез внутриклеточных. Это означает, что большая часть ферментов, образующихся в гифах факульта­тивных паразитов, выделяется в окружающую среду.

В литературе накоплено множество данных о вооруженности ферментами грибов — факультативных паразитов и сапротрофов. Среди экстрацеллюлярных ферментов названных грибов имеются разнообразные карбогидразы, осуществляющие гидролиз различ­ных ди- и полисахаридов (инулина, крахмала и др.), гемицеллю-лозы, клетчатки и т. п. Помимо выделения ферментов в окружаю­щую среду микроорганизмы могут воздействовать на питающий их субстрат путем контакта. Установлено, что подобное действие зависит от ферментов, локализованных на поверхности клеток. Активность и качественный состав выделяемых ферментов в онто­генезе грибов меняется. С возрастом может меняться и активность одного и того же фермента. Показано, что низкая ферментативная активность приурочена к моменту прорастания спор. По мере раз­вития гриба набор ферментов в его тканях расширяется и возрас­тает их активность. В стадии спорообразования она резко снижа­ется.

Сравнительное изучение биохимических свойств факультатив­ных и облигатных паразитов позволило установить, что прораста­ющие споры облигатного паразита менее богаты ферментами. Наиболее мощные протеолитические ферменты и амилазы у об­лигатных паразитов либо отсутствуют, либо обладают незначи­тельной активностью. Поэтому внедрение в ткани растения-хозя­ина облигатных паразитов не вызывает резких нарушений в его обмене веществ.

Гибель клеток растения-хозяина обусловлена действием токси­ческих для высшего растения веществ. Выявлены значительные различия в количестве и составе биологически активных веществ, синтезируемых фитопатогенами и они тем существеннее, чем четче выражены у патогенна паразитические свойства. Факультативные паразиты обладают способностью к образованию высокотоксичных веществ, вызывающих гибель тканей хозяина и создающих возможность успешного развития и распространения микроорганизмов. В большинстве случаев способность образовывать токсические вещества является признаком, выработавшимся и закрепившемся в процессе эволюционного развития и определяющим собой характер взаимоотношений паразита и растения-хозяина.

4. ГЕНЕТИКА, БИОХИМИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ ИММУНИТЕТА РАСТЕНИЙ

4.1 ПОЛЕВАЯ И ИСТИННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

Реакция растения на заражение инфекционными объектами находится под значительно более сложным генетическим конт­ролем, чем другие хозяйственно ценные признаки, такие, как ко­личество и качество продукции, срок созревания и т. п. Это обус­ловлено тем, что на степень пораженное™ растения оказывают влияние различные морфологические, анатомические, физиоло­гические и биохимические факторы. Например, сорта пшеницы, имеющие высокую скорость прорастания и прохождения ранних фаз роста, слабо поражаются твердой головней, а такие же сорта свеклы и хлопчатника устойчивы к корневым гнилям, вызванным комплексом почвообитающих грибов, лишь потому, что указан­ные паразиты способны заразить только молодые проростки, не приобретшие еще плотных покровных тканей. Сорта картофеля с рыхлой, раскидистой ботвой слабее, чем сорта с плотной ботвой, поражаются фитофторозом в связи с тем, что влага после дождя или ночи с обильным образованием росы на листьях первых сор­тов лучше проветривается и быстрее высыхает, так что зооспоры не успевают освободиться из зооспорангиев, инцистироваться, прорасти и внедриться в ткань листа. Виды барбариса, имеющие толстую кутикулу и наружную стенку эпидермиса, более устойчи­вы к возбудителю стеблевой ржавчины злаков Puccinia graminis, чем виды с тонкими покровами, поскольку проростки монокарио-тических базидиоспор внедряются в лист непосредственно через эпидермис. В то же время устойчивость злаков к этой болезни ни­как не связана с толщиной кутикулы, так как проростки дикарио-тичных эцио- и урединиоспор проникают через устьица. Сорта злаков с пониклыми листьями менее поражаются возбудителями листовых пятнистостей, чем сорта с листьями, расположенными под острым углом к стеблю, лишь по той причине, что инфекци­онные капли скатываются с листьев на грунт. Рожь сильно пора­жается спорыньей, а пшеница очень слабо в связи с разными стра­тегиями размножения: у ветроопыляемой ржи цветки долго оста­ются открытыми для заноса в них спор, а самоопыляемая пшеница имеет закрытое цветение.

Все эти и многие другие примеры устойчивости можно обнару­жить при полевой оценке сортов, но они могут не проявляться при искусственном заражении в лаборатории. Поэтому перечисленные примеры устойчивости объединяют общим понятием полевая устойчивость. Как видно, полевой устойчивостью управляют различные гены, и при отборе на её повышение часто используют косвенные признаки (скорость прохождения отдельных фаз онтогенеза, толщина кутикулы, габитус куста и т.д.), а не прямое заражение.

Альтернативная полевой – истинная устойчивость, которая проявляется не только в поле, но и при заражении отдельных от растения листьев в условиях, способствующих развитию болезни.

4.1.1. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИСТИННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

Если в основе полевой устойчивости лежат анатомоморфоло-гические и онтогенетические особенности растений, то истинная устойчивость обусловлена главным образом накоплением токси­ческих для паразита продуктов. Растение продуцирует огромное число разнообразных веществ, несущих защитные функции. Эта вещества различаются по химическому составу (от простейшей органической кислоты — щавелевой до высокомолекулярных бел­ков), мишеням (защищают от грибов, бактерий, вирусов, насеко­мых), механизмам действия (убивают патогенов, инактивируют орудия их агрессии — токсины, ферменты и др.), способам воз­никновения (присутствуют в интактных клетках, индуцируются заражением). Здесь будут рассмотрены особенности строения и механизма действия лишь некоторых представителей двух групп антибиотических веществ растений — низкомолекулярных соеди­нений (вторичных метаболитов) и белков.

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЗАЩИТНЫЕ ВЕЩЕСТВА. Их разделяют на два класса, названные фитоантиципины и фитоалекси­ны. Первые представляют собой низкомолекулярные антимик­робные соединения, присутствующие в растении до заражения или продуцируемые после механического повреждения клетки и заражения из предшественников. Вторые — низкомолекулярные антимикробные соединения, которые синтезируются и аккумули­руются в растении после взаимодействия с паразитом.

Фитоантиципины. История изучения фитоантиципинов началась после того, как в 1928 г. зоолог-эмбриолог Б. П. Токин обнаружил, что летучие соединения, образующиеся в результате растирания лука и чеснока, убивают простейших животных (ин­фузорий и др.). Эти летучие продукты Токин назвал фитонци­дами. Название было не очень удачным, ибо фитон по-гречески означает растение, а цидум по-латыни — убивать, то есть этот тер­мин — гибрид из разных языков, что не положено; к тому же дос­ловный его перевод — убивающие растения, хотя эти вещества продуцируются растениями, а убивают микроорганизмы. Тем не менее в отечественной фитопатологии этот термин прижился и получил широкое распространение, причем фитонцидами стали называть не только летучие, но и все остальные антимикробные соединения. Известный фитопатолог Д. Д. Ведеревский и его уче­ники проделали огромную работу по изучению влияния экстрак­тов растений на различные фитопатогенные объекты. К сожале­нию, информационная ценность этих исследований оказалась до­вольно низкой. Дело в том, что живая клетка представляет собой систему покрытых мембранами пузырьков (компартментов). Пока клетка жива, вещества, находящиеся в разных пузырьках, не взаи­модействуют друг с другом, но если ткань мацерировать, то клетка окажется поврежденной и вещества из разных компартментов (ва­куолей, лизосом, пероксисом и др.) придут в контакт друг с дру­гом и в результате химических реакций возникнут соединения, часто токсичные, которых в неповрежденных клетках не было. Например, корень хрена сам по себе не вызывает никаких непри­ятных ощущений, но если его натирать, то образуются летучие со­единения, токсичные для слизистых оболочек.

Большинство токсических веществ находится в живой клетке в форме гликозидов, то есть в соединении с одним или несколь­кими остатками Сахаров. Гликозиды менее токсичны, чем отде­ленные от остатков Сахаров агликоны, и поэтому неопасны для самой клетки; они водорастворимы и поэтому являются транспор­тной формой токсических веществ. Обычно они находятся в ваку­олях и отделены тонопластом от других компонентов клетки, что также защищает ее от повреждающего действия. При нарушении целостности клеточных мембран содержимое вакуолей выливает­ся в клетку и гликозиды входят в контакт с ферментами г л и к о -зидазами, находящимися в других мембранных пузырьках лизосомах или ковалентно связанными с полисахаридами клеточной стенки. Гликозидазы отщепляют сахара от гликозидов и освобож­дают высокотоксичные агликоны, убивающие клетку и находя­щихся в ней паразитов.

Классификация гликозидов основана на химическом строении агликонов.

Фенолы и фенольные гликозиды. Фенолами называют цикличес­кие соединения, содержащие ароматическое кольцо с фенильным гидроксилом или его замещенными радикалами (кислотным, аль­дегидным и др.). Многие растительные фенолы помимо фенила (С₆) содержат пропановый радикал (С₄) и названы фенилпропано-идами. Фенолы, с одной стороны, нормальные метаболиты расте­ний, так как входят в состав регуляторов роста, пигментов, струк­турных элементов клеточной стенки (лигнина), а с другой — это стрессовые метаболиты, синтез которых резко возрастает при по­ранении или при заражении. Они образуются в результате дезами-нирования аминокислоты фенилаланина с помощью фермента фенилаланин-аммиаклиазы (ФАЛ), активность которой обычно возрастает при стрессорных воздействиях (заражении, механическом повреждении, облучении), почему ФАЛ называют стрессовым ферментом.

Основные механизмы антимикробного действия фенолов сле­дующие.

• Продукты окисления фенолов полифенолоксидазами (ПФО) хиноны обладают высокой реакционной способностью. Они могут инактивировать белки вследствие формирования замещенных продуктов с SH-, NH₂-rpynnaMH белков. Как сильные окислители, хиноны акцептируют электроны от многих соединений.

• Фенолы влияют на трансмембранный транспорт веществ в клетке. Некоторые замещенные фенолы служат проводниками протонов в мембранах и вследствие этого действуют как разоб­щающие агенты.

• Промежуточные соединения биосинтеза фенолов могут вли­ять на метаболизм фитогормонов. Являясь ингибиторами фер­мента ИУК-оксидазы, многие фенолы способствуют накопле­нию фитогормона индолилуксусной кислоты (ИУК), а гормо­нальный статус растения оказывает существенное влияние на взаимоотношения хозяина и паразита.

• Фенолы принимают активное участие в создании химических барьеров. Продукты окисления фенольных спиртов (кумарилово-го, кониферилового, синапилового), конденсированные в резуль­тате свободнорадикальных реакций, образуют аморфный трехмер­ный полимер лигнин, откладывающийся в клеточных стенках (обычно во вторичных стенках и стенках мертвых клеток). Лигнин ковалентно связывается с полисахаридами клеточной стенки и за­щищает их от атаки грибными ферментами деполимеразами, пре­пятствует диффузии в клетки грибных метаболитов, обладает пря­мой токсичностью для микроорганизмов, может лигнифициро-вать (ограничивать в росте) гифы грибов, проникшие в клетки растений.

Важную роль в образовании лигнина играет другой стрессовый фермент — пероксидаза, активность которого, как и активность ФАЛ, возрастает при механическом повреждении тканей и при за­ражении. Пероксидаза осуществляет полимеризацию коричных спиртов в лигнин, формирует прочные сшивки между целлюло­зой, пектином, гликопротеинами клеточных стенок и лигнином, участвует в заживлении ран — отложении водонепроницаемого барьера из полимеризованных алифатических и ароматических соединений (суберинизации ткани), участвует в катаболизме (раз­ложении) ауксинов. В растительной клетке пероксидаза локализо­вана в разных компартментах и существует в нескольких изофор-мах.

• Катионные (рН 8,1..Л 1). Катализируют образование перокси-да водорода из НАДН и воды. Локализованы в центральной вакуо­ли. Обладают активностью ИУК-оксидазы и регулируют уровень ауксинов в клетке.

• Слабоанионные (рН 4,5...6,5). Локализованы в клеточных стенках. Умеренно активные лигнификаторы. Осуществляют су-беринизацию ран.

• Анионные (рН 3,5...4,0). Локализованы в клеточных стенках. Осуществляют лигнификацию и сшивки полисахаридов клеточ­ных стенок. Их активность регулируется уровнем ауксинов.

Фенолы находятся в клетках растения в свободном виде или в форме фенольных гликозидов. Например, сорта лука с окрашен­ными (желтыми и красными) чешуями устойчивы к заражению многими грибами (из родов Aspergillus, Alternaria и др.). Их окраска обусловлена фенольным гликозидом флавоновым пигментом кверцитрином, находящимся в вакуолях. Как известно, кро­ющие чешуи лука состоят из мертвых клеток. При их отмирании происходит разрушение внутриклеточных мембран, вследствие чего от фермента гликозидазы отщепляется фенольный агликон кверцитин, который под действием другого фермента полифено-локсидазы (ПФО) расщепляется с образованием низкомолеку­лярных водорастворимых монофенолов — протокатеховой кислоты и ортокатехола (рис.8). Эти фенолы обладают высокой фунгитоксичностью и, диффундируя в инфекционную каплю, убивают споры грибов.

В листьях яблони содержится фенольный гликозид ф л о р и д -зин, который при механическом повреждении листьев или при заражении возбудителем парши Venturia inaequalis гидролизуется ферментом Р-гликозидазой, образуя фенол флоретини глюко­зу. Флоретин окисляется фенолоксидазой с образованием высо­котоксичного, но нестабильного хинона. Обработка листьев перед заражением химическими соединениями — ингибиторами глико­зидазы и ПФО — превращает устойчивые сорта в восприимчивые к болезни.

Терпеноиды и терпеноидные гликозиды. К терпеноидам относят соединения, синтезируемые из уксусной кислоты путем конденса­ции ее молекул. Первый продукт конденсации — изопрен — со­держит пять атомов углерода. В по­строении терпеноидов участвуют две группы ферментов — полиме-разы, соединяющие молекулы изопрена в цепочку, и циклазы, осуществляющие преобразование цепочек в замкнутые кольца. При конденсации двух молекул изоп­рена образуются соединения, на­званные монотерпенами (С₁₀). Это низкомолекулярные летучие вещества, которые часто придают

растениям специфические запахи. Конденсация трех молекул изопрена приводит к образованию сесквитерпенов (С 15). Многие бициклические сесквитерпены токсичны для фитопатогенных организмов и являются важными факторами устойчивости. Таков м а з о н о н, накапливающийся в коре вяза и придающий ему ус­тойчивость к голландской болезни. Из четырех молекул изопрена состоят дитерпены (С20) — основные компоненты смол древесных растений. Многие дитерпены горькие на вкус (например, горький фактор огурца). При конденсации шести молекул изопрена обра­зуются тритерпеноиды. Они высокотоксичны, так как, связываясь с мембранами, вызывают образование пор, через которые проис­ходит утечка метаболитов. В растении тритерпеноиды находятся главным образом в гликозилированной форме, благодаря которой образуют мылящиеся в воде растворы: именно поэтому их называ­ют сапонинами (сапо по-латыни — мыло). Сапонины обладают выраженным антигрибным действием. Например, сапонин цикла­мена цикламин подавляет рост грибов в концентрациях ниже 200 мкг/мл. Сапонины представляют собой токсические начала таких ядовитых растений, как наперстянка, ландыш, куколь и др. (встречаются у представителей более 70 семейств растений). Агли-коном сапонинов у одних растений может быть пентацикличес-кий тритерпеноид (рис. 9), у других — тетрациклический стероид. У пасленовых и некоторых других растений к стероидному скеле­ту присоединен азотсодержащий гетероцикл (рис. 10). Такие со­единения называют гликоалкалоидами. К ним относится хорошо известный соланин, накапливающийся в ягодах и озелененных после выставления на свет клубнях картофеля. В зараженных рас­тениях от растворимого сапонина с помощью ферментов гликози-даз отщепляются сахара и терпеноидный агликон проявляет свою высокую токсичность.

Цианогенные гликозиды. У ряда растений (проса, лядвенца, сор­го и др.) содержатся своеобразные гликозиды (дурринин, линама-рин и др.), у которых при повреждении мембран сначала (3-глико-зидаза отщепляет глюкозу, а затем под действием другого фермента — оксинитрилазы — образуется сильнейший дыхательный яд — синильная кислота (рис. 11).

Тиогликозиды. У этих соединений агликон соединен с сахаром не через кислород, а через серу. В результате воздействия специ­фических гликозидаз (миронозидазы и др.) образуется ряд летучих высокотоксичных соединений (рис. 12). Тиогликозиды, или гл и -ценоляты, присущи растениям из семейства крестоцветных, которым они придают специфический запах от слабого у капусты до очень резкого у редьки и хрена, они также обнаружены у расте­ний некоторых других семейств.

Фитоалексины. В 1940 г. немецкие фитопатологи Мюллер и Бергер показали, что в клубнях устойчивых к фитофторозу сор­тов картофеля после заражения накапливаются токсические веще­ства, которые убивают мицелий патогена, развивающийся в тка­нях растения. Эти вещества были названы фитоалексинами (ФА). Согласно предложенной авторами концепции, ФА —низ­комолекулярные растительные антибиотики, которые отсутствуют

и в интактных, и в механически поврежденных тканях, но синте­зируются в ответ на заражение невирулентными видами и штам­мами патогенных грибов. Они локализованы в зоне заражения и не мигрируют в незараженные ткани.

Методы изучения ФА. Заражение срезов клубней картофеля, как это было сделано в первых опытах Мюллера, оказалось не вполне корректным методом изучения ФА, так как при разреза­нии клубня происходит повреждение клеток и образование опи­санных ранее стрессовых метаболитов — антиципинов. (Поэтому в лаборатории Л. В. Метлицкого на поверхности среза клубня спе­циальной ложечкой вырезают отверстия, промывают их водопро­водной водой для удаления стрессовых метаболитов, подсушивают и затем заполняют каплями со спорами.) Нанесение капель со спорами на поверхность листьев также неинформативно, посколь­ку кутикула препятствует обмену метаболитов в системе паразит-хозяин и накоплению ФА. Поэтому в качестве моделей для изуче­ния ФА Мюллер выбрал плоды гороха и фасоли. Он извлекал из створок бобов семена и в углубления во внутренней части плодов (семенные камеры) наносил водную суспензию спор гриба Monilia fructicola (возбудитель плодовой гнили яблони), непатогенного для бобовых. Таким образом, использовалась неповрежденная ткань, лишенная кутикулярного слоя. В опытах было два контроля: в се­менные камеры вносили капли воды без спор (контроль на нали­чие неспецифических антиципинов); суспензию спор наносили на предметные стекла во влажной камере (контроль на наличие автоингибиторов, выделяемых прорастающими спорами гриба). После определенной экспозиции капли собирали, отделяли от спор центрифугированием и в полученной жидкости проращива­ли свежую порцию спор М. fructicola. Ингибирование прорастания спор в опыте по сравнению с контролями свидетельствовало о диффузии ФА в инфекционную каплю. Кроме створок плодов бо­бовых растений использовали плоды и других растений, например перца, которые разрезали вдоль, извлекали семена и заливали сус­пензиями спор разных грибов. Для изучения ФА, образующихся в ответ на системную инфекцию грибами, локализованными в кси­леме, зараженные растения обрезали на пенек и собирали пасоку (жидкость, поднимаемую вследствие корневого давления). Так были изучены ФА хлопчатника, зараженного вертициллезным вилтом.

. Химическая природа ФА. В настоящее время описана структура нескольких сотен ФА из различных однодольных и двудольных ра­стений. По химической природе их разделяют на несколько групп.

Фенольные ФА. Большинство бобовых растений образует слож­ные фенольные ФА — изофлаваны (киевитон фасоли), изофлава-ноны (веститол лядвенца, сативан люцерны), птерокарпаны (пи­затин гороха, фазеоллин фасоли, глицеоллин сои, медикарпин люцерны). Общая структура этих групп соединений показана на рисунке 13. Как видно, они содержат два фенольных кольца, син­тезируемых разными метаболическими путями (через шикимовую и через уксусную кислоты). Активность фермента, соединяющего эти кольца — халконсинтетазы, увеличивается вслед за заражени­ем. Биосинтез ФА бобовых показан на рисунке 14.

У арахиса и винограда два фенольных кольца ФА ресвератро-ла (рис. 15) соединяет другой фермент— стильбенсинтетаза (СТС). Гены, контролирующие синтез СТС, были методами генной ин­женерии перенесены из винограда Птерокарпан ^в табак, томаты и картофель, ко­торые стали продуцировать ресве-ратрол и проявили устойчивость к Botrytis cinerea, Phytophthora infestans и Fusarium sulfureum.

Терпеноидные ФА. У растений из семейства пасленовых иден­тифицировано большое число ФА, имеющих сходную природу и различающихся лишь конеч­ными этапами биосинтеза; все они являются бициклическими сесквитерпенами (рис. 16). Изофлаванон Как видно, с одной стороны, один и тот же ФА может синте­зироваться растениями из раз­ных семейств (ресвератрол — в арахисе и винограде), а с другой – растения одного семейства продуцируют группу родственных по химической природе ФА. Некоторые исследователи использовали структуру ФА в хемосистематике растений.

Рис. 13. Основные структуры флавоновых фитоалексинов

Ресвератрол ОН Н ОН Н ОН

4-Пренилресвератрол ОН Прения ОН Н ОН

Оксиресвератрол ОН Н ОН ОН ОН

4-Пренилоксиресвератрол ОН Прения ОН ОН ОН

Птеростильбен ОСН3 Н ОСН3 Н ОН

Токсичность ФА для фитопатогенов. ФА высокотоксичны для многих грибов, слаботоксичны для фитопатогенных бактерий и не тормозят развитие вирусов. В качестве показателя относительной токсичности ФА обычно используют ЭД50 (концентрация, снижающая скорость роста мицелия в питательной среде в 2 раза). Первыми исследованиями не удалось установить связи между устойчивостью растения к болезни и ЭД50 ФА. Например, при испытании токсичности ФА гороха пизатина по отношению к 50 видам

грибов было показано, что один из паразитов гороха — Ascochyta pisi — оказался среди самых устойчивых видов (ЭД50 116 мкг/мл), а другой — Septoriapisi— среди самых чувствительных (ЭД50 10 мкг/мл). Между ними расположились многие виды, не поражающие горох. Однако когда стали изучать* индукционную способность разных видов грибов, оказалось, что споры A. pisi вызывают образование пизатина в очень высокой концентрации, а споры S. pisi — в очень низкой. Поэтому было сформулировано правило: вид или штамм гриба может паразитировать на данном виде или сорте растения, если он индуцирует образование ФА в нетоксичной для него концентрации. Это наглядно показано в таблице 1, составленной японскими фитопатологами по данным, полученным ими при заражении гороха двумя мучнисто-росяными грибами — паразитом злаков Erysiphe (Blumeria) gra-minis и паразитом гороха Е. pisi. Как видно из представленных в таблице 1 данных, синтез пизатина в ответ на заражение паразитом злаков Е. graminis начинается значительно раньше, чем в ответ на заражение Е. pisi, он достигает в 25 раз более высокой концентрации и в 13 раз более токсичен. Следовательно, концентрация пизатина в горохе, зараженном Е. graminis, в 50 раз выше летальной для патогена дозы, а в горохе, зараженном Е. pisi, в 7 раз ниже.