Клональное микроразмножение древесных пород

В Беларуси посадочный материал подразделяется на 3 класса: класс А - (virus free - свободный от вирусов); класс Б (virus test - тестированный на вирусы); класс В (visual healthy - визуально здоровый). Для получения посадочного материала класса А необходимы тщательный отбор, оздоровление и тестирование исходных растений на наличие вирусных и микоплазменных заболеваний. Растения класса А являются основным, а в перспективе - единственным видом посадочного материала.

Высокий уровень распространения вирусов снижает продуктивность растений, в связи с чем для получения качественного посадочного материала класса А необходимы термотерапия и культура in vitro. Наибольшее распространение для микроразмножения плодовых и ягодных культур получил метод пролиферации придаточных побегов. Для снятия эффекта апикального доминирования в этом случае используются цитокинины. Процесс происходит по описанной ранее схеме и имеет некоторые особенности, связанные со спецификой культур. На этапах 0 и 1 важными являются предподготовка растения, правильный выбор сроков взятия эксплантов (период выхода из состояния покоя и активной вегетации). На этих этапах проводится оздоровление посадочного материала, для чего применяют метод апикальных меристем в сочетании с термотерапией. Для термотерапии плодовых культур используют однолетние саженцы, которые культивируют в термокамерах при температуре 38 ±1°С, относительной влажности 70-80%, освещенности 5-6 тыс. люкс, длине дня 16 часов в течение 5-11 недель. После термотерапии срезают верхушки побегов, промывают водой 2 часа, стерилизуют в 0,1%-м растворе сулемы 6-12 мин., промывают стерильной дистиллированной водой и вычленяют под микроскопом в ламинар-боксах апикальные меристемы размером до 0,5 мм. Меристемы культивируют на модифицированных средах Мурасиге, Скуга. Для инициации роста побегов из меристем используют цитокинины (чаще всего 6-БАП в концентрации 0,1-1мг/л). Физические условия культивирования - температура 22-26°С, освещенность 2,5-5 тыс. люкс, влажность 70-75%. Побеги вишни, сливы, яблони, груши образуются в течение 2,5 месяца.

На этапе 2 главной задачей является размножение побегов. Для увеличения эффекта размножения побеги пересаживают на среду, содержащую 1-3 мг/л 6-БАП. Под воздействием повышенных концентраций цитокининов активизируются пробуждение почек в пазухах листьев, закладка и прорастание дополнительных почек. За один пассаж на среде для размножения формируется конгломерат побегов размером от 0,5 до 2,0 см (лучше больше 1 см). Число побегов в конгломерате зависит от особенностей культуры и колеблется от 4 до 20 шт. Коэффициент размножения в процессе нескольких пассажей может возрастать. Оптимальное число пассажей 5-6. Длительность пассажа 4-6 недель. Способность к пролиферации в значительной степени зависит от сорта.

На этапе 3 побеги укореняют, для чего концентрацию среды Мурасиге, Скуга уменьшают наполовину, содержание сахарозы - до 20 г/л. Для индукции ризогенеза используют индолилмасляную кислоту в концентрации 0,5-1 мг/л. Длительность корнеобразования может составлять 3-6 недель.

На этапе 4 проводится адаптация микрорастений в нестерильных условиях. Пробирочные растения после укоренения высаживают в стерильный субстрат, состоящий из смеси торфа, песка, перлита и почвы, который стерилизуют при температуре 85-90°С в течение двух часов. Субстрат насыпают в горшочки или ящики, которые устанавливают в теплице. Для адаптации растения в теплице укрывают пленкой в течение 10-14 дней для поддержания высокой влажности. Через 5-8 дней после посадки растения подкармливают раствором Мурасиге, Скуга, разбавленным в 4-8 раз, или раствором Кнопа. После адаптации растения высаживают для создания маточника в теплицу или открытый грунт в начале или середине вегетации. Клональное микроразмножение декоративных пород широко распространено в Западной Европе и США. Имеется большой опыт микроразмножения и получения безвирусного посадочного материала в ряде научных и производственных учреждений СНГ (Институт физиологии растений РАН, Центральный ботанический сад НАН Беларуси, цветоводческое хозяйство «Элита»). Разнообразие пород очень велико.

Сотрудниками Никитского ботанического сада совместно со специалистами совхоза «Оранжерейный комплекс» разработана технология получения безвирусного посадочного материала хризантем для закрытого грунта. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала начинается с термотерапии. Сортовые черенки берут с маточных растений, предварительно тестированных на вирусы, высаживают в контейнеры. После 2-3 прищипок растения помещают в термокамеру. Адаптацию к повышенной температуре начинают с 25°С и доводят до 37°С. Термотерапия продолжается 4-10 недель в зависимости от состава выявленных вирусов при освещенности 3,5-4,0 тыс. люкс и фотопериоде 14,5 часа. У растений, прошедших термотерапию, берут черенки длиной 5-7 см и дезинфицируют их в 1%-м растворе гипохлорита натрия в течение 5 мин. с последующим 5-кратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Вычленяют апикальные и латеральные меристемы размером 0,3-0,4 мм в ламинар-боксах и помещают на жидкую питательную среду. Пробирки с эксплантами культивируют при температуре 22-23°С, освещенности 2,5-3,0 тыс. люкс в течение 16 часов. Образовавшийся каллус через 2-3 недели в асептических условиях пассируют на агазированную питательную среду, где в течение 3 недель происходит регенерация проростков, которые пересаживают на среду для укоренения. После укоренения растения высаживают в контейнеры с субстратом (2 части торфа и 1 часть перлита), поливают раствором Кнопа и накрывают полиэтиленовыми изоляторами на 7-10 дней. После формирования 5-6 листьев растения тестируют на вирусы. Безвирусные растения используют для закладки маточника.