Лабораторная работа 1. Хроматографическое определение аминокислот

           Метод распределительной хроматографии на бумаге является одной из модификаций хроматографического метода, предложенного М.С.Цветом в 1903 г. С помощью этого метода осуществляется разделение и определение аминокислот в смеси. Суть метода заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску фильтровальной бумаги, конец которой опускают в подходящий органический растворитель. Растворитель увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты, скорость перемещения которых зависит от химического строения и их способности растворяться в растворителе. Чем меньше растворимость аминокислот в воде и больше растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они перемещаются за фронтом органического растворителя. Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить путем цветной реакции с нингидрином: производят опрыскивание из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,1-0,2%-ным спиртовым раствором нингидрина. Аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета в зависимости от структуры аминокислоты. Скорость перемещения отдельных аминокислот может быть выражена с помощью коэффициента распределения (R_f).

           Коэффициентом распределения называется отношение расстояний от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (а) к расстоянию от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (b):

           Выполнение работы. На нижнем конце полоски хроматографической бумаги длиной 10 см, шириной 4,5 см на расстоянии 1 см от края отчеркивают карандашом черту и на нее наносят капиляром поочередно примерно через 0,5-0,8 мм каждую из предложенных аминокислот и контрольную задачу из смеси аминокислот. Нанесение капиляром повторяют 2-3 раза (для большей яркости пятен). Сверху подписывают карандашом названия аминокислот. Приготовленную бумажную полоску опускают в хроматографическую камеру с водонасыщенным бутанолом таким образом, чтобы она погрузилась в жидкость на 2-3 мм. Камеру плотно закрывают пришлифованным стеклом и оставляют на 30-60 мин. За это время фронт растворителя поднимается на 9 см, полоску достают, высушивают и опрыскивают из пульверизатора раствором нингидрина, снова высушивают и нагревают над плиткой. В местах, где присутствуют аминокислоты, появляются синие или фиолетовые пятна, их обводят карандашом и вычисляют коэффициенты распределения аминокислот по выше указанной формуле. Данный метод позволяет определять микроколичества аминокислот. Наряду с восходящей хроматографией нередко используют и радиальную хроматографию.

           Выполнение радиальной хроматографии. Бумажный диск диаметром 12 см (большим, чем диаметр чашки Петри) делят карандашом на 4 равные части. В центре диска делают небольшой вырез, в который помещают ножку высотой 2 см, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки. В центре карандашом чертят круг диаметром 1 см и на него в каждый сектор наносят капилляром определенную аминокислоту, подписывают ее сверху карандашом, бумажный диск высушивают. На дно чашки Петри наливают примерно 10 мл водонасыщенного раствора бутанола, бумажный диск накладывают на края чашки Петри так, чтобы ножка касалась раствора, чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 1 ч, затем хроматограмму проявляют спиртовым раствором нингидрина, бумажный диск высушивают. Вычисляют R_f  (аналогично восходящей хроматограмме).

           Указания к составлению отчета по работе

           Студенты записывают принцип хроматографического метода, зарисовывают или подклеивают в тетрадь полученные хроматограммы. Линейкой измеряют расстояние от места нанесения капли раствора до середины каждого пятна и от места нанесения капли раствора до линии фронта растворителя, вычисляют коэффициент распределения для каждой аминокислоты. Сопоставлением пятен на хроматограмме и вычисленным R_f определяют состав аминокислот в задаче.