Лабораторная работа 3. Реакции осаждения белка

 

           Опыт 1. Осаждение белков при кипячении

           Почти все белки свертываются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении нейтральной соли (NaCl и др.). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения положительного заряда в сильнокислой среде и увеличения отрицательного заряда в щелочной среде.

           При понижении рН диссоциация карбоксильной группы подавляется и молекула становится положительно заряженной. При повышении рН происходит отрыв протона аминогруппы и молекула приобретает отрицательный заряд. Наиболее полное и быстрое осаждение белков происходит в изоэлектрической точке (это такое значение рН, при котором частицы белка не передвигаются в электрическом поле ни к аноду, ни к катоду). Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН~5).

           Порядок выполнения опыта. В 5 пробирок наливают по 5 капель 1%-ного раствора яичного белка. Первую пробирку нагревают до кипения, при этом жидкость мутнеет. Во второй пробирке раствор белка нагревают до кипения и прибавляют 1 каплю1%-ного раствора уксусной кислоты. При стоянии выпадает хлопьевидный осадок белка, т.к. частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку добавляют 5 капель 1%-ного раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции среды. При кипячении осадок не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, повышая их устойчивость. В четвертую пробирку приливают 5 капель 1%-ного раствора уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают, выпадает белый хлопьевидный осадок белка, т.к. его частицы теряют заряд вследствие взаимодействия белка с ионами хлористого натрия. В пятую пробирку добавляют 2 капли 10%-ного раствора едкого натра. При кипячении жидкости осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

           Указания к составлению отчета: Необходимо отметить положительный результат осаждения плюсом, а отрицательный – минусом и сделать выводы по работе касающихся изоэлектрической точки.

Нейтральная среда	Слабокислая среда	Сильнокислая среда	Сильнокислая среда + электролит	Щелочная среда

 

 

           Опыт 2. Высаливание

           Высаливанием называют осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH₄)₂SO₄ и др. Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка и одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация одних и тех же солей. Хлористый натрий осаждает слабее, чем сернокислый аммоний, вследствие меньшей дегидратирующей способности. При высаливании белок обычно не теряет своих естественных свойств, например, он может вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет разделить белки на различные белковые фракции: альбумины, глобулины и др.

           Порядок выполнения опыта. 1). В пробирку наливают 20 капель раствора белка и прибавляют порошок хлористого натрия до полного насыщения раствора. Через несколько минут появляется осадок глобулинов. Содержимое пробирки отфильтровывают, в фильтрате остается альбумин, который в нейтральных растворах не выпадает даже при добавлении хлористого натрия. К фильтрату прибавляют по каплям 1%-ный раствор уксусной кислоты (15-20 капель), альбумин выпадает в осадок, его отфильтровывают и проверяют фильтрат на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции;

           2) К 15 каплям раствора белка добавляют 15 капель насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают, выпадает осадок глобулинов. Его отфильтровывают, в фильтрате остается альбумин, к нему добавляют порошок сернокислого аммония до полного насыщения. Выпадает осадок яичного альбумина, его отфильтровывают, фильтрат проверяют на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.

           Указания к составлению отчета: необходимо отметить положительный результат осаждения белков плюсом, а отрицательный – минусом; Результаты занести в таблицу и сделать выводы о высаливающей способности указанных растворов.

 

Применяемый раствор белка и название белковых фракций	Что осаждается в насыщенном растворе NaCl	Что осаждается в слабокислой среде после высаливания NaCl	Что осаждается в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4	Что осаждается в насыщенном растворе (NH4)2SO4  ?

 

 

           Опыт 3. Осаждение белков солями тяжелых металлов

           Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания, происходит при небольших концентрациях солей. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых осадков используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др.

           Порядок выполнения опыта. 1. Осаждение медным купоросом. К 5 каплям раствора яичного белка прибавляют 1 каплю 10%-ного раствора сернокислой меди, образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. В другой пробирке к такой же порции белка приливают 1 каплю 10%-ного раствора сернокислой меди, а затем еще 10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива.

2. Осаждение белков уксуснокислым свинцом. К 5 каплям раствора белка приливают 2 капли 5%-ного раствора уксуснокислого свинца. Образуется нерастворимый в воде осадок, но легко растворяющийся в избытке осадителя.

           Указания к составлению отчета: результаты реакций записывают в таблицу. Появление осадка обозначают плюсом, растворение осадка – минусом и делают обоснованные выводы по работе.

Название веществ, осаждающих белки	Употребляемые реактивы	Характер и цвет осадка	Чем обусловлена реакция. Каковы ее особенности?

 

 

Опыт 4. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка. В избытке минеральных кислот (за исключением азотной) выпавший осадок белка растворяется.

Порядок выполнения опыта: а) осаждение азотной кислотой. К 5 каплям концентрированной азотной кислоты приливают по стенке пробирки равный объем раствора белка. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца;

           б) осаждение серной кислотой проводят аналогично. При избытке кислоты образующийся осадок растворяется.

 

Опыт 5. Осаждение белков органическими кислотами

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков. Наибольшее применение получили трихлоруксусная CCl₃COOH и сульфосалициловая C₆H₃(OH)(COOH)SO₃H.

Порядок выполнения опыта: а) осаждение сульфосалициловой кислотой. К 5 каплям раствора белка добавляют 2 капли 20%-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Выпадает осадок белка;

б) осаждение трихлоруксусной кислотой проводят аналогично.

 

Опыт 6. Осаждение белков органическими растворителями

В органических растворителях (спирт, ацетон) белки не растворяются. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Успешнее реакция проходит в присутствии хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц белка. При кратковременном действии и на холоду реакция осаждения белка спиртом обратима. При длительном воздействии происходит денатурация белка.

Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка приливают 15-20 капель этилового спирта (или ацетона), раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия, при стоянии выпадает осадок белка.