2018-03-09
228
При проведении переэтерификации логично использовать избыток ацил-акцептора для смещения равновесия реакции к образованию продуктов, однако если ацил-акцептор имеет менее трех углеродных атомов в цепи, особенно метанол, его избыток инактивирует фермент.
В целом, основной технологической проблемой липазного катализа является инактивация липазы высокими концентрациями спиртов. Однако субстрат тоже может ингибировать фермент. Так было выяснено [70], что при пререэтерификации липазой Rhizomucor miehei в среде н-гексана с использованием метанола и пальмового масла лимитирующими концентрациями являлись 3 М и 1,25 М соответственно.
Для преодоления проблемы инактивации существуют следующие решения.
Постепенное добавление спирта. Поскольку метанолу, из применяющихся ацил-акцепторов, свойственна наибольшая ингибирующая способность, многие авторы предлагают постепенное его добавление в среду [14, 15, 19, 26, 34, 39, 48, 51, 61, 62]. Обычно применяют двух- [33, 46] и трехступенчатое добавление [9, 18, 32, 33, 56]. Таким путем можно избежать больших концентраций метанола в реакционной среде.
|
|
|
Например, в работе [51] был получен выход биодизеля более 90% без значительной потери активности через, по крайней мере, 54 цикла.
Использование растворителей. Различают липазный катализ, как в среде реагентов, так и в среде органического растворителя.
Если алкоголиз проводится без использования растворителя, растворимость спирта в масле является лимитирующим фактором, так как не растворившийся спирт, по-видимому, обволакивает поверхность липазы, тем самым инактивируя ее. Жирные спирты с длиной цепи более трех углеродных атомов полностью растворяются в масле в стехиометрическом количестве, но растворимость метанола и этанола составляет приблизительно половину и две трети от стехиометрического количества соответственно [51]. Поэтому этанол ингибирует ферменты несколько менее чем метанол, но все же значительно [10]. Исходя из растворимости метанола, молекулярное соотношение метанол:масло более 1,5:1 дает заметную деактивацию большинства липаз при условии, что не используется растворитель [51].
Среди коммерческих препаратов Novozym 435 более стоек к инактивации, однако при тех же условиях Lipozyme TL IM требует меньше этанола для достижения того же выхода [22].
Стратегия использования растворителя подразумевает подбор такого растворителя, который бы одновременно растворял и спирт, и масло.
Помимо преодоления инактивации липаз органические растворители подавляют гидролиз и понижают вязкость реакционной среды, что очень важно при использовании насадочных реакторов. Одна из трудностей их использования заключается в извлечении растворителя из реакционной среды, для чего необходимо выпаривание, а, следовательно, дополнительные затраты и потери. Кроме того, органические растворители часто не менее токсичны, чем метанол, но их использование – действенный и универсальный способ избежать деактивации ферментов и получить большой выход продукта. Промышленная реализация процессов с использованием растворителей проблематична. С экологических и технологических позиций ферментативный катализ с применением растворителей предпочтительнее щелочного (рекуперация растворителей менее сложная задача, чем утилизация щелочных стоков), но высокая цена на сами растворители не позволяет достичь приемлемых экономических показателей.
|
|
|
Масла очень хорошо растворяются в неполярных растворителях, среди которых наиболее часто используют н-гексан [1, 3, 9, 16, 31, 34, 35, 38, 49, 55, 56], реже изооктан [11, 23] и гептан [13]. Кроме того, есть данные [71], что гексан и изооктан ускоряют ацил-миграцию.
Однако растворители средней полярности имеют преимущество, поскольку способны растворять масло и спирт одновременно. Из них наиболее широко применяется трет-бутанол [4, 21, 36, 43, 47, 56], благодаря относительно невысокой цене. Для примера характера, оказываемого на процесс воздействия полярности растворителя можно привести исследование [56] по метанолизу триолеина (катализатор – липаза из Candida sp. 99-125, иммобилизованная на полиуретановой пене). Реакция проводилась в присутствии различных растворителей (ДМСО, ацетонитрил, ацетон, ТГФ, трет-бутанол, CH2Cl2, бензол, CHCl3, толуол, CCl4, н-гексан, циклогексан) и различным содержанием воды (0%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10% по весу) при однократном и трехступенчатом введении метанола в реакционную среду. В результате при трехступенчатом введении метанола выход продукта увеличивался на порядок, лучшими растворителями оказались бензол, толуол, CCl4, н-гексан и циклогексан, по крайней мере, для липазы Candida sp. 99-125. Причем, наблюдалась зависимость между видом растворителя, содержанием воды в реакционной смеси и выходом МЭЖК. При использовании полярных растворителей (ДМСО, ацетонитрил, ацетон, ТГФ, трет-бутанол) увеличение количества воды уменьшало выход, а для неполярных (CH2Cl2, бензол, CHCl3, толуол, CCl4, н-гексан, циклогексан) наоборот – увеличивало.
В работе [20] в качестве среды для переэтерификации соевого масла были использованы ионные жидкости как альтернатива органическим растворителям. При этом, молярное соотношение метанол:масло было доведено до 4:1 и был получен выход МЭЖК 80%, что на 15% выше, чем при реакции в среде трет-бутанола и в восемь раз больше, чем без растворителя. Однако хоть ионные жидкости огне- безопасны и во многом более приемлемы, чем органические растворители, они на сегодняшний день существенно дороже.
Использование безопасных для липаз ацил-акцепторов. Еще одним обходом инактивации является проведение реакции переэтерификации с использование таких ацил-акцепторов, как метилацетат [18, 23] и этилацетат [30], в качестве альтернатив метанолу и этанолу соответственно. При этом следует заметить, что при пере- этерификации вместо глицерина образуется более ценный побочный продукт – триацетин.
Так в [18] использовался метилацетат для превращения соевого масла (катализатор Novozym 435). Не было обнаружено никакого ингибирующего воздействия на липазы, был получен выход 92%, и активность липаз оставалась стабильной более 100 циклов. При использовании метанола уже при молярном соотношении метанол:масло более 1:1 наблюдалось значительное ингибирование липазы, в то время как с метилацетатом без ущерба для липаз при- менялось соотношение 12:1. При проведении реакции с нерафинированным соевым маслом и метанолом был получен выход лишь около 30%, вследствие деактивации липаз фосфолипидами [8], которые не влияли на реакцию с метилацетатом, вероятно, из-за его большой концентрации (выход также 92%).
|
|
|
В работе [30] при использовании этилацетата для получения биодизеля из масла ятрофы и подсолнечника (катализатор – Novozym 435) также наблюдались аналогичные преимущества перед этанолом. При переэтерифика- ции активность липаз сохранялась более 12 циклов реакции, тогда как при этанолизе она терялась уже за 6.
Тем не менее, стоимость этих ацил-акцепторов при переэтерификации намного выше, чем соответствующих спиртов, и, к тому же, обычно для реакции требуется большое молярное отношение ацил-акцептора к маслу. Токсичность сложных эфиров так же достаточно высока, что не способствует их широкому промышленному использованию.
Удаление глицерина. В некоторых работах утверждается, что липазы теряют часть активности из-за присутствия глицерина в реакционной среде, который, накапливаясь в реакторе, обволакивает поверхность ферментов. Для борьбы с этим предлагается удалять глицерин in situ путем диализа [26] или же вести трансэтерификацию в трет-бутаноле [21] или изопропаноле [19], которые растворяют глицерин. Предварительная обработка биокатализатора. Среди методов уменьшения деактивации ферментов стоит также выделить их предварительную обработку эфирами жирных кислот. В работе [17] эффект ингибирования метанолом был значительно уменьшен путем выдерживания липаз в течение получаса в метилолеате, а затем еще 12 ч в соевом масле, подлежащем метанолизу.
В работе [72] показано, что предварительное выдерживание липазы Novozym 435 в 2-бутаноле или трет-бута-ноле повышает активность фермента в 10 раз.
Достаточно перспективна недавно исследованная [41] ультразвуковая предварительная обработка липаз. Авторы работы, воздействуя ультразвуком на липазы из Burkholderia cepacia и Pseudomonas fluorescens, добились увеличения степени конверсии в реакции трансэтерификации масла ятрофы с 34% до 79%. Спектры кругового дихроизма и сканирующая электронная микроскопия позволили сделать вывод, что воздействие ультразвука производит значительные морфологические изменения ферментов с возмущением третичной структуры и некоторым изменением микроокружения ароматических аминокислот, что в конечном итоге и приводит к увеличению биокаталитической активности.
|
|
|
Восстановление активности липаз. Деактивированная липаза может быть восстановлена выдерживанием в спиртах, содержащих три и более углеродных атома, предпочтительно 2-бутанол или трет-бутанол [72]. В данном исследовании авторам удалось восстановить этими спиртами, соответственно, около 56% и 75% начальнойактивности полностью деактивированной липазы Novozym 435.
Следует отметить уникальное преимущество ферментов относительно небиологических катализаторов, состоящее в огромном потенциале их генетического совершенствования. Так недавно из штамма G63 Burkholderia cepacia была выделена термостойкая (после выдерживания 10 ч при 70°С сохранялись 86,1% активности) липаза, устойчивая к большим концентрациям метанола (выдерживание 48 ч в 50% метаноле – сохранение 98,3% активности). [7] Применение данной липазы для производства биодизеля несомненно весьма перспективно.
Заключение. Липазный катализ в производстве биодизеля призван избавить его от принципиального недостатка – большого количества щелочных отходов, снизить удельные затраты воды и энергии. В экономическом плане сегодня липазный катализ проигрывает щелочному, однако, в работе [73] показано, что при современных ценах на липазу, производство био- дизеля рентабельно начиная от объемов от 200 тыс. т./год. Предположительная цена биодизеля, если не применять при его получении растворитель (в этом варианте технология нерентабельна), окажется равной 0,73–1,49 €/кг при текущей цене липазы, и 0,05–0,75 €/кг при прогнозируемой цене фермента в будущем. Стоит добавить, что цена ферментов, помимо увеличения масштабов производства, может быть снижена путем применения технологий рекомбинантных ДНК. Таким образом, ферментативный способ производства биодизеля при создании крупных производств и соответствующей экологической политике государства уже в ближайшем будущем сможет конкурировать со щелочным катализом. В настоящее время единственной областью рентабельного применения липаз (иммобилизованых) является переработка закисленных масел с биологическими ацил-акцепторами, среди которых наиболее доступен и перспективен биоэтанол. Тогда как такой выбор субстрата объясняется тем, что закисленные масла во множестве образуются как отходы пищевых производств по всему миру и к ним нерационально применять щелочной катализ – теряются СЖК и идет перерасход катализатора на их нейтрализацию.
1.3 ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПАЗ
Липазы широко применяются в качестве биокатализаторов, в смесях растительных жиров и масел, в процессе переэтерификации для получения ценных продуктов масложировой промышленности [5], заменителей молочных жиров и масла какао, специализированных жиров, которые являются важнейшими ингредиентами пищевых продуктов. Также применяют липазы в агрохимической, фармацевтической, химической, косметической, кожевенной, текстильной промышленности, медицине, в сельском хозяйстве (в производстве кормовых добавок), в области охраны окружающей среды (для очистки стоков мясной, масложировой промышленности) [6,7,8]. Эти промышленности другим видам очистки поддаются намного труднее [5]. Наиболее перспективным использованием липаз, в качестве биокатализатора является биодизельная технология. Что касается коммерческих ферментных препаратов липаз, то их уже давно используют как биодобавки, в производстве моющих средств.
В работе [12] были исследованы ферментативный гидролиз касторового, и его особенности. Реакция проводилась под действием липаз выделенной из Candida rugosa, в системе масло/вода. Авторы применяли множество химических методов активации органических растворителей и липаз.
При использовании системы масло/вода, эмульсии, получаемые при соотношении 40:5 (масло:вода), обладали наибольшей устойчивостью. Такая эмульсия была устойчива в течение 60-70 минут. Концентрация ферментативного препарата в количестве 1 мг/мл оказал существенное влияние на выход жирных кислот. Оптимальной температурой гидролиза, является температура 45 °С [2,3,4]. Также на повышение выхода высших жирных кислот [13] повлияло перемешивание эмульсии, оптимальной частотой перемешивания в данной работе – 200 об./мин [12].
Для того, чтобы повысить эффективность ферментативного гидролиза, необходимо повысить термостабильность самих ферментативных препаратов, и их каталитическую активность. Активность ферментов, также, как и скорость ферментативной реакции, в большей степени определяется лишь присутствием в среде ингибиторов и активаторов. Как известно, ингибиторы притормаживают реакцию, а активаторы повышают скорость этой реакции. Использование таких соединений, которые активируют и стабилизируют ферменты, позволит сократить расходы на покупку дорогостоящих ферментных препаратов, тем самым будет иметь существенный экономический эффект [14,15,16,17].
В статье [18], изучили и провели исследование влияние различной природы соединений, в бездетергенной эмульсии на ферментативный гидролиз касторового масла. Было установлено, что увеличение глубины гидролиза по максимуму достигается только при введении ионов магния в концентрации 0,03 М/л и ионов кальция в концентрации 0,02 М/л. При внесении в среду органических растворителей, а именно хлороформа, диэтилового и петролейного эфиров, оказывает неоднозначный эффект [18].
В работе [5], используя вышеописанный метод, добавляют хлорид цинка, дающий высокий активирующий эффект, при малых концентрациях (0,01 М/л), в течение первого часа проведения реакции. Однако, наблюдался эффект ингибирования, с возрастанием времени процесса, и при увеличении концентрации хлорида цинка свыше 0,05 М/л.
В переработке растительных масел важным процессом является гидролиз масла, с помощью (липаз) липолитических ферментов [19]. Получение полиненасыщенных моно- и диацилглицеридов, и их жирных кислот, которые обладают уникальным биологическим действием [19], а также экологичные процессы производства биодизеля [20], представляют особый интерес. Эффективным решением данной проблемы является использование синтетических эмульгаторов [21].
Как правило, биоэмульгаторы, не загрязняют окружающую среду, нетоксичны для ферментов, и хорошо работают в широком диапазоне температур, солености среды и рН. Очень часто, в литературе, в последние годы появляются сведения о возможном осуществлении биотрансформаций в эмульсиях, которые, в свою очередь, стабилизируются биоэмульгаторами [22,23].
Другим, наиболее перспективным вариантом повысить активность липаз является процесс иммобилизации.
Иммобилизация – это введение молекул фермента в изолированную фазу, отделенную от фазы свободного раствора, и способную обмениваться с молекулами субстрата, находящимися в ней. Такое присоединение, к нерастворимому носителю фермент, будет иметь множество преимуществ. А именно, иммобилизованные ферменты легко удаляются из реакционной смеси, даже простой фильтрацией. Такой фермент используется многократно, что с экономической точки зрения – целесообразно, даже несмотря на затраты, которые связанны с иммобилизацией. Но в процессе исследования и изучения этих ферментов возник огромный минус. Оказалось, что свободные ферменты менее устойчивы к внешним воздействиям, чем изучаемые [24].
В настоящее время, для иммобилизации липаз исследуют современные силикатные материалы, такие, как синтетические силикаты с контролируемой пористостью, кремниевые аэрогели. На мезопористом диоксиде кремния проводили иммобилизацию липазы из Mucor javanicus путем физической адсорбции фермента с последующей кросс-сшивкой глутаровым диальдегидом [25].
В работе [26] были получены клетки Escherichia coli и Pseudomonas putida с иммобилизованной на клеточной стенке термостабильной липазой из Pseudomonas fluorescens. Иммобилизацию фермента проводили с помощью «якорного» белка из Pseudomonas syringae. При таком способе иммобилизации была ликвидирована проблема массопереноса субстрата внутрь клетки. Активность биокатализатора составила 350 ЕА/г сухих клеток. Иммобилизованная таким способом липаза полностью сохранила свою активность в двухфазной реакционной среде «вода-изо-октан» при гидролизе оливкового масла, синтезе триацилглицерида и разделении хиральных изомеров. Несомненно, что конструирование и поиск природных новых штаммов-продуцентов внутриклеточных липаз с заданными свойствами, является интересным и перспективным направлением в молекулярной биологии, микробиологии и гетерогенном биокатализе [27]. Выход иммобилизации, при таком раскладе составил 85 %.
Lipozyme TL IM – липаза, получаемая из Thermomyces lanuginosus, иммобилизованная на гранулированном силикагеле.
В работах [4, 21] был применен метод комбинированного использования 1,3-региоспецифичной (Lipozyme TL IM) и неспецифичной (Novozym 435) липаз.)
Учитывая то, что стоимость Novozym 435 намного больше стоимости Lipozyme TL IM, применение этого метода позволяет снизить себестоимость биодизеля.
Иммобилизованная и свободная липазы, также использовались в водной среде, при гидролизе оливкового масла. При сравнении исследований, было выявлено, что липаза иммобилизованная, показывает сдвиг оптимума pH с 6,9 до 7,5 (свободная липаза). При данных показателях, термостабильность свободной липазы возрастает на 20-25 %, а начальная активность после 7 циклов составила – 75 %. Препарат также показал хорошую и высокую стабильность, при внесении органических растворителей (самая хорошая стабильность, при введении 30 % ацетона и метанола) [28].
В работе [29] провели синтез сложных метиловых эфиров жирных кислот (биодизеля) с помощью препарата иммобилизованных мультилипаз в таблице 1.2 показан процент образованных сложных метиловых эфиров жирных кислот в реакции трансэстерификации с помощью препарата мультилипаз, иммобилизованных на неполярный полимерный адсорбент, включавших либо липазу Thermomyces lanuginosa и липазу Candida antarctica В, либо липазу Pseudomonas species и липазу Candida antarctica В, которые были иммобилизованы по отдельности, или вместе на один и тот же носитель, в одностадийной системе. Также, вместо липазы Candida antarctica В использовали липазу из Alcaligenes species в комбинации с липазами Pseudomonas species или Thermomyces lanuginosa. Реакции проводили путем добавления препарата иммобилизованных липаз (30 г) к соевому маслу (220 г) и метиловому спирту (23,9 г) в стеклянном реакторе с двойной рубашкой, имеющем дно с фильтром из спеченного стекла с пористостью 70-100 мкм. Реакционную смесь механически перемешивали при 30 °С в течение 6 ч [29].
Результаты, представленные в таблице 1.2, показывают, что липазы Thermomyces lanuginosa и Pseudomonas species не способны образовывать процент образованных сложных метиловых эфиров жирных кислот в концентрациях, превышающих 95 %, через 6 ч реакционного времени. Препарат иммобилизованных мультилипаз, включающий липазы Thermomyces lanuginosa и Candida antarctica В, неожиданно продемонстрировал более высокую трансэстерификационную активность. Как показано в таблице 1.2 препарат иммобилизованных мультилипаз, содержавший липазу Pseudomonas species и Candida antarctica В, также демонстрирует улучшенную и синергическую трансэстерификационную активность, обычно составляющую более 99% [29].
Таблица 1.2 – Процент образованных сложных метиловых эфиров жирных кислот в реакции трансэстерификации (FAME, %) [29]
| Липаза, иммобилизованная на неполярный полимерный адсорбент | FAME, % через 2 ч | FAME, % через 3 ч | FAME, % через 6 ч |
| Липаза Thermomyceslanuginosa (контроль) | 75,0 | 82,0 | 85,0 |
| Липаза Pseudomonasspecies (контроль) | 74,0 | 81,0 | 86,0 |
| Липаза Candida antarctica В (контроль) | 10,0 | 18,0 | 42,0 |
| Липаза Alcaligenesspecies | 52,0 | 67,0 | 88,0 |
| Липазы Thermomyces lanuginosa и Candida antarcticaВ | 82,0 | 87,0 | 96,0 |
| Липазы Pseudomonas species и Candida antarctica В | 82,0 | 96,0 | 99,7 |
| Липазы Alcaligenes species и Thermomyces lanuginosa | 71,0 | 78,0 | 96,0 |
| Липазы Alcaligenes species и Pseudomonas species | 86,0 | 98,0 | 99,5 |
Наиболее известными, и широко применяемыми иммобилизованными ферментами, являются коммерческие биокатализаторы компании «Novozymes». «Novozym 435» (pH 5-9, t = 30-60°C) – липаза, которую получают из Candida antarctica, иммобилизованная на макропористом полиметилметакрилате.
Они приготовлены с помощью иммобилизации рекомбинантных липаз, используемые различные носители, такие как ионообменные смолы и силикагель. Данные коммерческие биокатализаторы, участвуют в процессах получения в масложировой промышленности ценных продуктов [24].
В патенте [30] получили смесь полиэлектролитов для использования очистки животноводческих отходов и сточных вод, в сельском хозяйстве. Техническим эффектом предлагаемого изобретения является повышение активности целевого продукта в комплексе из двух полимеров. Технический эффект достигается в предлагаемом способе получения в полиэлектролите путем иммобилизации липазы тем, что вместо полиэлектролита используют смесь полистиролсульфоната натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлорида, которые были взяты в массовых соотношениях равных 0,3:1-1,0, только иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза:смесь полистиролсульфоната натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 50:1-200 и при температуре 18-24 °С, рН 9,0-11,0, в течение 10-20 мин. Способ позволяет получить целевой продукт с повышенной ферментативной активностью.
Получают смесь полиэлектролитов полистиролсульфоната натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлорида, в соотношении 0,3:1, путем смешивания 100 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида и 30 мг полистиролсульфоната натрия. Далее к 100 мг полученной смеси добавляют 1 мг липазы, полученной из поджелудочной железы свиньи (соотношение липаза:полиэлектролит 1:100). Иммобилизацию проводят в течение 10 мин при рН 9,0 при температуре 18 °С [30].
Полученную иммобилизованную липазу проверяли на ферментативную активность по отношению к субстрату триацетину. В результате активность иммобилизованной липазы составила 180 % по отношению к контролю.
Благодаря тщательному изучению ферментативных реакций возможно получение промышленно-ценных продуктов. В частности, при переработке именно касторового масла, основной интерес представляет рицинолевая кислота (в касторовом масле ее содержится до 85 %), так как, она имеет доступную сырьевую базу, а перспективным субстратом ее делает наличие оптически активного С12 центра, для получения хиральных полифункциональных соединений. Рицинолевая кислота, также представляет огромный интерес для медицины, обладая эффективным противовоспалительным, противогерпетическим и бактерицидным действием [5].
Доказано, что высокой проникающей способностью обладает рицинолевая кислота, благодаря эмульгирующим свойствам хорошо растворяет большое количество веществ и увлекает их за собой сквозь слизистые оболочки, значительно повышая степень усвоения лекарственных препаратов. Одна из современных форм применения рицинолевой кислоты - липосомы.
Доказано, что рицинолевая кислота, согласно данным патентной литературы [31,32] легче, чем растительные масла, проникает в глубокие слои кожи, волосяные фолликулы, ускоряя протекающие там обменные процессы. На клеточные мембраны, рицинолевая кислота, оказывает стабилизирующее действие, защищает их от неблагоприятных внешних воздействий и восстанавливает целостность. Является одним из ценных видов сырья в производстве различных душистых веществ, а также используется для восстановления повреждений эпителия и слизистых в дерматологии, гинекологии и др. В органическом синтезе она используется для получения ундециленовой[12], азелаиновой и себациновой кислот, ПАВ [33,34].
За рубежом рицинолевая кислота широко используется в комплексной терапии. Одновременно продолжают исследовать широкий спектр её целебных свойств и разрабатывают новые методы её применения.
По результатам зарубежных исследований препараты с рицинолевой кислотой рекомендованы как натуральные, безопасные и эффективные для длительного лечения хронических воспалительных заболеваний слизистых в гинекологии, офтальмологии, урологии и т. д., а также для лечения трофических изменений кожи, в хирургии и эндокринологии.
При нанесении её на слизистые эффект неоднозначен. Рицинолевая кислота активно включается в структуру слизистых, изменяя их химизм. Из-за этого может возникнуть умеренное раздражение. Однако при повторном или длительном применении развивающийся противовоспалительный эффект значительно и достоверно превосходит первоначальное раздражение.
Исследования препаратов рицинолевой кислоты на предмет цитотоксичности к перевиваемым монослойным культурам клеток показали, что под их действием тормозится размножение перерожденных клеток.
В отчетах центров зарубежной альтернативной медицины имеются сообщения о достигнутых успехах в коррекции токсических осложнений после химио- и радиационной терапии, устранении болевого синдрома, противовирусной V бактериальной и иммуностимулирующей активности рицинолевой кислоты, стимуляции синтеза эндогенных простагландинов в толстой кишке и многое другое [34].
Настоящее исследование было направлено на оптимизацию переменных процесса как температура, рН, фермент и буферная концентрация для максимизации продукции рицинолеиновой кислоты посредством ферментативного гидролиза касторового масла. В этом исследовании анализировались индивидуальные, кумулятивные и интерактивные эффекты этих переменных при производстве рицинолеиновой кислоты. Таким образом, моделирование поверхности отклика на основе полной факториал центральный составной дизайн и численная оптимизация с использованием «Design Expert Software». С помощью этой работы оптимальные значения переменных процесса были следующими: температура 40 °С, рН 7,72, концентрация ферментов 5,28 мг/г масла и концентрация буфера 1 г/г масла и прогнозируемая максимальная конверсия за 6 ч составляет 65,5 % в этих условиях. Реальный эксперимент при тех же условиях дал 63 % конверсии. Из значений р, соответствующих каждой переменной, и их членов взаимодействия, ясно, что концентрация фермента и буфера прямо пропорциональна.
2 ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА БИОТРАНСФОРМАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО МАСЛА С ПОЛУЧЕНИЕМ ЦЕННОГО ПРОДУКТА
| Приготовление раствора субстратов, 10 -15 мин, t = 22-25 °С |
хлороформ
касторовое масло
| Гидролиз касторового масла в каталитическом биореакторе, t = 45 °С |
пар
конденсат
фермент
| Сбор раствора гидролизата |
пар конденсат
| Отгонка растворителей, t = 40 °С, р = 0,5 МПа. |
вода питьев.
| Сбор гидролизата |
глицерин
| Сбор жирных кислот |
| Промывка гидролизата, соотношение гидролизата:вода 1:4 t = 23-24 °С |
Рисунок 2.1 Технологическая схема биотрансформации растительного масла с получением ценного продукта.
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Сырье и материалы, используемые для исследования
Касторовое масло. Касторовое масло – прозрачное, вязкое и густое, жирное и не текучее масло, в окрасе которого допустимы легкие желтоватые переливы, почти незаметные при использовании. Консистенция масла крайне специфична и во многом неприятна, в несколько раз превышая по степени вязкости и густоты характеристики других базовых масел.
Масло оставляет вяжущее ощущение в ротовой полости, воспринимается при употреблении внутрь как непривычно плотное, при этом вкус у него своеобразный, глицериновый и не слишком приятный, но легкий и ненасыщенный.
Аромат масла почти неощутим, он слегка напоминает восковые нюансы с выраженно глицериновой основой, но в целом воспринимается обонянием как почти незаметный. Касторовое масло можно использовать в чистом виде, смешивать с другими маслами или веществами, средствами и составами, добавлять в готовые или домашние средства. Состав: касторовое масло. Минимальная объемная доля пюре 25 %. Изготовитель: ООО «Тульская фармацевтическая фабрика»
Качественное, настоящее касторовое масло, которое можно использовать в косметических и лечебных целях, получают методом холодного отжима (cold pressed), а вот любое масло, полученное горячей дистилляцией или при помощи растворителей, является маслом низкого качества и применять его в ароматерапевтических процедурах не рекомендуется.
Основу масла составляет рицинолеиновая кислота, достаточно редко встречающаяся в других базовых маслах и составляющая 90% всего масла. Кроме того, в касторке содержатся линолевая, олеиновая, пальмитиновая и стеариновые кислоты.
Касторка считается уникальной еще и потому, что она состоит исключительно из жирных кислот мононенасыщенного, насыщенного и полиненасыщенного класса, и кроме витамина Е и производных жирных кислот не содержит витаминов, минералов, фитостеролов и других компонентов.
Специфика состава обуславливает и совершенно особенные качества масла: касторка на 95% растворяется в этаноле, красная касторка – в воде, смешивается со спиртом, хлороформом, охлажденной уксусной кислотой и эфиром, густеет, но не затвердевает на воздухе и приобретает вязкую густую консистенцию при отрицательных температурах. Эти свойства активно использует лако-красочная промышленность, медицина, бытовая химия.
Касторка считается уникальной еще и потому, что она состоит исключительно из жирных кислот мононенасыщенного, насыщенного и полиненасыщенного класса, и кроме витамина Е и производных жирных кислот не содержит витаминов, минералов, фитостеролов и других компонентов.
Специфика состава обуславливает и совершенно особенные качества масла: касторка на 95% растворяется в этаноле, красная касторка – в воде, смешивается со спиртом, хлороформом, охлажденной уксусной кислотой и эфиром, густеет, но не затвердевает на воздухе и приобретает вязкую густую консистенцию при отрицательных температурах. Эти свойства активно использует лако-красочная промышленность, медицина, бытовая химия.
Поведение масла после нанесения на кожу также весьма специфично. Несмотря на свою сверхплотность и вязкость, густоту и специфическую консистенцию, касторка равномерно и легко распределяется по кожным покровам и волосам, создает жирную, плотную защитно-смягчающую пленку, которая полностью не омыляется при контакте с водой.
Жирное и моментально смягчающее, касторовое масло даже при разовом применении оказывает разглаживающий эффект, а его способности глубокого питания и повышения гладкости кожи и вовсе не знают равных среди растительных основ.
Наиболее заметно быстрое влияние масла клещевины на кутикуле, которая после нанесения масла быстро восстанавливает эластичность и привлекательный вид.
Из-за своего специфического аромата и неприятно-вязкой текстуры касторка при использовании вызывает не совсем приятные ощущения, но позитивные аспекты ее влияния на кожу и волосы намного перевешивают жирность и густоту масла.
Поскольку касторка тяжело смывается с волос, ее использование усложнено необходимостью тщательного промывания.
ЛЕЧЕБНЫЕ СВОЙСТВА
Целебные свойства касторового масла ограничены достаточно узкой сферой. Это и сегодня одно из самых эффективных и натуральных слабительных средств с мягким воздействием, не приводящее к нарушению естественной регуляции работы кишечника. В качестве слабительного касторку принимают внутренне, эффект наступает через 2, максимум 8 часов.
Кроме того, масло стимулирует родовые процессы и усиливает лактацию.
Но главным направлением применения масла в медицинских целях остается использование его вязкой консистенции и смягчающих свойств для создания бальзамов и мазей с самыми разными функциями – от заживления до защиты поврежденной кожи.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КОСМЕТОЛОГИИ
Касторовое масло является одним из самых древних косметологических масел. Исторически его использовали для ухода за волосами, ресницами и бровями в качестве питающего, восстанавливающего, дарящего красоту и здоровье средства, но и в уходе за кожей лица оно не менее эффективно.
ДЛЯ УХОДА ЗА КОЖЕЙ
Обладая сверхэффективностью в качестве смягчающего средства, оно способствует качественному клеточному питанию и восстановлению, разглаживанию и регенерации, возвращает коже упругость и эластичность.
Маслу клещевины свойственно выравнивание цвета кожи, в частности, отбеливающий эффект и устранение пигментных пятен. Уже после первого использования касторки кожа становится заметно более ровной и гладкой, а месячный курс позволяет эффективно бороться с мелкими морщинками.
Это одно из лучших масел для ухода за тонкой и нежной кожей вокруг глаз, которой необходимо постоянное питание и защита.
Ввиду специфичной плотности масло используют в основном для ухода за сухой или склонной к чувствительности кожей лица, на жирной и проблемной коже оно может оказать комедогенный эффект. И даже на сухой коже его применяют, обязательно комбинируя с пилингом хотя бы раз в 10 дней, устраняющим последствия воздействия масла.
Касторка – масло антивозрастное, с общим защитно-восстанавливающим влиянием. Текстура масла позволяет эффективно восстанавливать растрескивающуюся кожу, ее разглаживающее и смягчающее влияние способствует рассасыванию шрамов, рубцов, кистозных образований, наростов, бородавок.
ДЛЯ УХОДА ЗА РЕСНИЦАМИ И БРОВЯМИ
Касторовое масло – основное растительное средство по уходу за ресницами, стимулирующее их рост, позволяющее улучшить внешний вид и густоту.
Смягчающее и питательное воздействие заметно и при воздействии на брови, которые становятся более шелковистыми, густыми и привлекательными.
ДЛЯ УХОДА ЗА ВОЛОСАМИ
Это самое древнее терапевтическое средство для улучшения состояния волос, для возвращения им здоровья и красоты.
Касторка избавляет от проблем с состоянием кожи головы, в частности, от излишней сухости, позволяет преодолеть проблемы с перхотью. Но главная ее функция – одновременное воздействие на внешние характеристики волос и на их структуру, укрепление волосяных фолликул и активное стимулирование роста волос.
ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ
Касторовое масло принадлежит к мягким базовым маслам, которые практически не имеют противопоказаний к применению и лишены побочных эффектов. Единственное исключение – прием внутрь больших доз касторки по сравнению с рекомендуемыми дозами, что может вызвать тошноту, неприятные ощущения и болевые проявления со стороны желудочно-кишечного тракта.
Касторовое масло не стоит использовать в течение беременности ввиду активного стимулирования родовой деятельности и лактации, а также при отравлениях бензолом и фосфором, другими жирорастворимыми соединениями.
ПРАВИЛА ХРАНЕНИЯ
Несмотря на то, что данное масло полностью устойчиво к прогорканию, состав жирных кислот может меняться под воздействием воздуха, света и температур, а соответственно после открытия масла могут измениться и его характеристики и свойства.
Касторка – база с ограниченным сроком хранения, которая сохраняет свои характеристики лишь в течение 1-2 лет, при этом хранить масло нужно плотно закрытым, в темной таре и с защитой от доступа к свету. После начала использования касторовое масло можно хранить только в холодильнике.
МЕТОДЫ ПРИМЕНЕНИЯ МАСЛА КЛЕЩЕВИНЫ
Применение масла как в медицинских, так и в косметических целях существенно ограничено его плотностью и вязкостью. В ароматерапии касторовое масло применяют как в чистом, так и в разбавленном виде.
Неразбавленная касторка помогает решить специфические проблемы и используется для внутреннего употребления. Также масло подмешивают к косметическим средствам и разнообразным эмульсиям как питательный или смягчающий компонент в виде 10%-ой добавки.
Пищевая ценность на 100 г продукта:
- Белки: 0,0 г
- Жиры: 99,9 г
- Углеводы: 0,0 г.
Примечание: Продано в сотрудничестве с Novozymes A / S только для исследовательских целей.
Novozym ® 435 представляет собой липазу CALB, иммобилизованную на гидрофобном носителе (акриловой смоле). Продукт представляет собой неспецифическую липазу происходящих из Candida Antarctica B. Ключевые области применения включают динамическое кинетическое разрешение спиртов в сочетании с рутением
Катализатор и динамическое кинетическое разрешение амина в сочетании с металлическим расимизирующим агентом.
Липаза CALB стабильна в относительно широком диапазоне рН, особенно в щелочном диапазоне рН. Фермент проявляет очень высокую степень субстратной специфичности, как в отношении регио- и энантиоселективности. Lipase CALB широко используется в разрешение рацемических спиртов, аминов, кислот и при получении оптически активных соединений из мезо-субстратов.
Полученные оптически чистые соединения очень трудно получить по альтернативным маршрутам и могут иметь большую синтетическую ценность. Аналогично, CALB интенсивно используется в качестве региоселективного катализатора в селективном ацилировании различных углеводов.
Объявленная активность 10000 PLU / g. Липаза, которая гидролизует сложноэфирные связи в глицеридах. Цвет может варьироваться от партии до партии. Интенсивность цвета не является показателем активности фермента. Упаковка должна храниться в целости и сохранности, в сухом месте и вдали от солнечного света. Пожалуйста, следуйте
Рекомендации и использовать продукт до достижения наилучшего до даты, чтобы избежать необходимости в более высокой дозировке.
Преимущества:
1. Мягкие и селективные на многофункциональных подложках.
2. Активен как для объемных жидких веществ, так и в присутствии органических сорастворителей.
3. Хорошо работает в безводных условиях и с чувствительными к влаге субстратами.
4. Функции в широком температурном диапазоне (20 - 110 °)
5. Подходит как для резервуаров с мешалкой, так и для реакторов с непрерывным неподвижным слоем.
6. Может быть переработана 5-10 раз без потери активности, в зависимости от условий реакции.
7. Используется в крупномасштабном промышленном производстве.
8. Остатки белка Nil в конечных продуктах
| Наименование товара | Приложения | Специфичность субстрата |
| Новозим 435 | Динамическое разрешение спиртов в сочетании в рутениевым катализатором. Динамическое кинетическое разрешение амина в сочетании с рацемизирующим агентом металла | Эфиры и спирты |
| Наименование товара | Источник | Оптимальные условия |
| Новозим 435 | Candida antartica B | PH 5-9 Температура 30 – 60 0С |
Иммобилизация может осуществляться либо путем адсорбции фермента на твердой подложке.
В Novozymes промышленные ферменты производятся с использованием процесса под названием «погруженная ферментация». Это включает выращивание тщательно отобранных микроорганизмов (бактерий и грибов) в закрытых сосудах, содержащих богатый бульон питательных веществ (ферментационная среда) и высокая концентрация кислорода (аэробные условия). Поскольку микроорганизмы разрушают питательные вещества, они производят желаемые ферменты. Первым шагом в сборе ферментов из ферментационной среды является удаление нерастворимых продуктов, прежде всего микробных клеток. Обычно это делается путем центрифугирования или микрофильтрации. Поскольку большинство промышленных ферментов являются внеклеточными - секретируются клетками во внешнюю среду - они остаются в ферментированном бульоне после удаления биомассы. Затем ферменты в оставшемся бульоне концентрируют путем выпаривания, мембранной фильтрации или кристаллизации в зависимости от их предполагаемого применения.
Активность фермента Novozym 435 - 10000 PLU/г (PLU/г – пропиллауратных единиц, единицы в пересчете на пропиллаурат как субстрат).
2. Lipozyme TL IM – липаза, получаемая из Thermomyces lanuginosus, иммобилизованная на гранулированном силикагеле.
Изготовитель (производитель): "NovozymesNorthAmericaInc", 77 ParryChapelChurchRoad, Franklinton, NC 27525 (США), "NovozymesA/S" (Krogshoejvej 36, DK-2880 BagsvaerdDenmark) (Дания)
Получатель: Представительство АО "Новозаймс А/С" (Дания), 119330, Москва, Ломоносовский проспект, д. 38 (Российская Федерация)
Продукция соответствует: "Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)"
Область применения: в пищевой промышленности для производства кулинарных и кондитерских жиров, жировых основ для маргаринов и спрэдов, для переэтерификации жиров
Протоколы исследований: экспертные заключения ГУ НИИ питания РАМН №72/Э-1177/и-08 от 29.05.2008 г.
Этикетка: наименование продукции, название и адрес фирмы-изготовителя, масса нетто, дата изготовления, срок годности, условия хранения
Гигиеническая характеристика:
| Токсичные элементы, мг/кг, не более: свинец | 10,0 |
| мышьяк | 3.0 |
| Афлатоксин В1 (мг/кг, не более) | не допускается |
| Микробиологические показатели: КМАФАнМ (КОЕ/г, не более) | 50000 |
| БГКП (колиформы) в 0,1 г | не допускаются |
| E.Coli в 25 г | не допускается |
| патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, в 25,0 г | не допускаются |
| антибиотическая активность | не допускается |
| живые клетки-продуценты | не допускается |
| Получен с использованием ГММ (штамм Aspergillus Oryzae) |
| Номер фермента. | Порядковый номер в каталоге | Наименованиепродукции | Активность* | Формулировка | Оптимальный pH | Температурный оптимум | Специфичность субстрата |
| 1. | 06-3123 | Novozym® 435 | 10000 PLU/g | Иммобилизованный | pH 5-9 | 30-60°C | Эфиры и спирты |
| 06-3155 | Lipozyme® TL IM | 250 IUN/g | Иммобилизованный | pH 6-8 | 50-75°C | Эфиры | |
| 06-3120 | Novozym® 40086 | 275 IUN/g | Иммобилизованный | pH 7-10 | 30-50°C | Эфиры | |
| 06-3105 | Lipozyme® CALB L | 5000 LU/g | Жидкость | pH 5-9 | 30-60°C | Эфиры и спирты | |
| 06-3118 | Palatase® 20000 | 20000 LU/g | Жидкость | pH 7-10 | 30-50°C | Эфиры | |
| 06-3140 | Lipozyme® TL 100 L | 100 KLU/g | Жидкость | pH 7-10 | 20-50°C | Эфиры и диэфиры | |
| 06-3100 | NovoCor® AD L | 6000 LU/g | Жидкость | pH 5-9 | 30-60°C | Стерильно затрудненные сложные эфиры | |
| 06-3125 | Resinase® HT | 50 KLU/g | Жидкость | pH 5-8 | up to 90°C | Эфиры | |
| 06-3135 | Novozym® 51032 | 15 KLU/g | Жидкость | pH 7-10 | 35-70°C | Эфиры |
Для проведения гидролиза был использован следующий подход.
В качестве катализатора гидролиза растительных масел, в данном случае касторового, использовали липолитические ферментные препараты «Novozym 435», «LipozymeTLIM» и «LipozymeCalBi».
Для осуществлениягидролиза касторового масла липолитическими ферментными препаратами «Novozym 435», «LipozymeTLIM» и «LipozymeCalBi» в маловодной системе использовали гетерегонную среду: к увлажненному ферментному препарату (твердая фаза) добавляли раствор масла в среде органического растворителя (гексан:хлороформ 4:1). Суспензию выдерживали 1-48 часов без перемешивания.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Гидролиз масла липазой в системе масло/вода
В настоящее время, возрос интерес исследователей к рицинолевой кислоте, так как, она имеет доступную сырьевую базу (источником ее служит касторовое масло, в котором содержание рицинолевой кислоты доходит до 85 %), а наличие оптически активного С12 центра, делает ее перспективным субстратом для получения хиральных полифункциональных соединений. Кроме того, рицинолевая кислота представляет интерес для медицины (в косметологии), так как обладает эффективным бактерицидным, противовоспалительным и противогерпетическим действием.
Гидролиз масла ферментным препаратом липазы в отсутствии химического эмульгатора осуществляли следующим образом: масло эмульгировали в воде с помощью высокоскоростного диспергатора PhilipsXeniumk 700. Для приготовления эмульсии в диспергатор помещают различные объемы масла и воды (соотношение об/об 1:1, 1:2 и т.п). После чего тщательно перемешивают в течение 2 минут.
Эмульсию разливали по 20 мл в 5 плоскодонных колб. В 4 колбы вносят по 10 – 30 мкл ферментного препарата липазы и аккуратно перемешивают. Колбы помещают в шейкер-инкубатор.
Реакция осуществляется при температуре 25-450С с интенсивным перемешиванием (число оборотов – 200) в течение 1 - 4 часов. Отбор проб осуществляют каждый час. По окончании реакции полученные гидролизаты центрифугируют в течение 5-10 минут при 3000 об/мин. Верхний слой, содержащий жирные кислоты отделяют и отбирают три пробы по 1 мл из каждого образца.
В каждую пробу 1 мл добавляют по 2 мл этилового спирта. Пробы тщательно перемешивают и методом титрования определяют количество выделившихся жирных кислот. Титрование проводят 0,1 н водным раствором NaOHв присутствии 1% раствора фенолфталеина до устойчивой розовой окраски.
Пятая колба контроль. Ее содержимое центрифугируют 5 – 10 минут при 3000 об/мин. Верхний слой, содержащий жирные кислоты отделяют и отбирают 2 пробы по 1 мл в колбы. В каждую пробу вносят 2 мл этилового спирта. Пробы тщательно перемешивают и методом титрования определяют количество выделившихся жирных кислот.
Выход жирных кислот (мкМ/мл) рассчитывали по формуле:
А = (О – К) * Т * 100/ В,
где О – количество 0,1 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование пробы, мл;
К – количество 0,1 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование контроля, мл;
Т – титр щелочи;
100 – коэффициент пересчета в мкмоли жирных кислот;
В – количество пробы, взятой на титрование, мл.
2.2.2 Гидролиз масла в маловодной системе
В пробирки вносят по 10 мг ферментного препарата и буферный раствор (фосфатный буфер pH=6,8 – 7,2). Все пробирки выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре.Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл масла и выдерживают при температуре 370С в течение 60 минут.
В каждую пробу добавляют по 2 мл этилового спирта. Пробы тщательно перемешивают и методом титрования определяют количество выделившихся жирных кислот. Титрование проводят 0,1 н водным раствором NaOH в присутствии 1 % раствора фенолфталеина до устойчивой розовой окраски.
Контрольная проба готовится следующим образом: В пробирку вносят 50 мкл буферного раствора и 0,5 масла. Пробу выдерживают в течение часа при температуре 370С. Затем в контрольную пробу добавляют 10 мг ферментного препарата, 2 мл этилового спирта и сразу же титруют раствором щелочи до устойчивой розовой окраски.
3РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Растительные масла и продукты их переработки могут служить источником различных промышленно важных веществ. Получение свободных жирных кислот методомхимического гидролиза растительных масел сопровождается образованием побочныхтемноокрашенных продуктов, протекает при высокой температуре и часто, приповышенном давлении.
Ферментативный гидролиз в отличие от химического гидролиза,протекает в мягких условиях.
Предлагаемый в данной работе способ гидролиза вотсутствии эмульгаторов упрощает технологию целевого продукта, снижает количествопобочных продуктов и облегчает процесс выделения целевых жирных кислот, априменяемый катализатор обеспечивает экологическую безопасность процесса.
Касторовое масло представляют интерес, как масло, в котором преобладает определенная жирная кислота (рицинолевая) и, эти масла, соответственно, может служить сырьем для их получения.
3.1 Гидролиз касторового масла ферментным препаратом «Novozym 435» в маловодной системе
В настоящее время, возрос интерес исследователей к рицинолевой кислоте, так как, она имеет доступную сырьевую базу (источником ее служит касторовое масло, которое содержит до 85 % рицинолевой кислоты), а наличие оптически активного С12 центра, делает ее перспективным субстратом для получения хиральных функциональных соединений. Кроме того, рицинолевая кислота представляет интерес для медицины, так как обладает эффективным бактерицидным, противоспалительным и противогерпетическим действиями.
Наибольший выход жирных кислот наблюдался при ранее установленных оптимальных условиях проведения процесса гидролиза касторового масла с применением в качестве катализатора ферментного препарата «Novozym 435»: температура 45 °С, соотношение органических растворителей (гексан:хлороформ) 4:1, количество вносимого буферного раствора 10 мкл/см3(см. таблица 3.1.1 – 3.1.4).
Таблица 3.1.1– Влияние количества добавляемого буферного раствора
| Количество буферного раствора, мкл | Количество 0,1н NaOH, пошедшего на титрование, мл | Среднее значение | ||
| 10 | 0,05 | 0,06 | 0,065 | 0,058 |
| 20 | 0,04 | 0,01 | 0,01 | 0,024 |
Анализ полученных данных таблицы 1 показал, что активирующий эффект наблюдается при добавлении 10 мкл буферного раствора.
Таблица 3.1.2– Влияние времени на ферментативный гидролиз растительного масла
| Количество времени, ч | Количество 0,1н NaOH, пошедшего на титрование, мл | Среднее значение | ||
| 1 час | 0,05 | 0,06 | 0,065 | 0,058 |
| 2 часа | 0,04 | 0,09 | 0,12 | 0,083 |
| 3 часа | 0,24 | 0,22 | 0,29 | 0,25 |
| 24 часа | 0,6 | 0,55 | 0,6 | 0,58 |
Анализ полученных данных таблицы 2 показал то что увеличение времени гидролиза ведет к большему количеству выделившихся жирных кислот.
Таблица 3.1.3– Влияние температуры на ферментативный гидролиз растительного масла. Время гидролиза 24 часа
| Температура | Количество 0,1н NaOH, пошедшего на титрование, мл | Среднее значение | ||
| 37 0С | 0,6 | 0,55 | 0,6 | 0,58 |
| 45 0С | 0,66 | 0,68 | 0,66 | 0,67 |
Анализ полученных данных таблица 3 показал, чтопри повышении температуры улучшается процесс выделения жирных кислот.
С целью дальнейшего повышения выхода целевого продукта будет исследовано влияниена процесс гидролиза касторового масла введение в реакционную смесь неорганическихсолей и их оксидов, а также органических растворителей.
Таблица 3.1.4– Влияние добавления хлороформа и гексана на ферментативный гидролиз растительного масла
| Время, при 450С | Хлороформ, мл | Гексан, мл | Среднее значение |
| 1 сутки, 450С | 0,5 | - | 0,65 |
| 1 сутки, 450С | 0,25 | 0,25 | 1,13 |
| 1 сутки, 450С | 0,1 | 0,4 | 1,62 |
Анализ полученных данных показал, что при добавлении органических растворителей гексан:хлороформ, в соотношении 4:1 наблюдается максимальный положительный эффект.
3.2 Гидролиз касторового масла ферментным препаратом «LipozymeTLIM» в маловодной системе
Также было установлено, что при прочих равных условиях, применение ферментного препарата «LipozymeTLIM» позволяет осуществлять гидролиз касторового масла примерно на 30 % эффективнее, по сравнению с ферментным препаратом «Novozym 435».
Таблица 3.2.1 – Гидролиз касторового масла иммобилизованными ферментными препаратами
| Используемый для гидролиза ферментный препарат | Выход жирных кислот за 24 часа, мкМоль/ см3 касторового масла |
| «Novozym 435» | 290 |
| «LipozymeTLIM» | 382 |
На следующем этапе работы изучалось влияние содержания воды в системе на глубину гидролиза касторового масла ферментным препаратом «LipozymeTLIM» (см. таблица 3.6).
Условия проведения процесса гидролиза: концентрация ферментного препарата
10 мг/см3; концентрация касторового масла в реакционной среде 50 %; температура проведения процесса 45 °С; содержание воды в реакционной системе 10-30 мкл/см3.
Таблица 3.2.2 – Влияние содержания воды в системе на глубину гидролиза
| Содержание воды мкл/см3 реакционной среды | Выход жирных кислот, мкМоль/ см3 касторового масла |
| 10 | 382 |
| 20 | 960 |
| 30 | 690 |
Анализ полученных данных таблицы 3.6 показал, что при добавлении воды в количестве 20 % к объему реакционной среды, выход жирных кислот значительно увеличивается. Но дальнейшее увеличение содержания воды в системе не приводит к повышению выхода жирных кислот, вероятно из-за образования слишком объемной гидратной оболочки вокруг гранул ферментного препарата и уменьшения доступности гидрофобного субстрата для фермента.
3.3 Гидролиз касторового масла ферментным препаратом «LipozymeCalBi» в маловодной системе
Наибольший выход жирных кислот наблюдался при ранее установленных оптимальных условиях проведения процесса гидролиза касторового масла с применением в качестве катализатора ферментного препарата «LipozymeCalBi»: температура 37 °С, соотношение органических растворителей (гексан:хлороформ) 4:1, количество вносимого ферментного препарата 10 мкл/см3, оптимальное время проведения гидролиза – 24 часа(см. таблица 3.3.1 – 3.1.4).
Таблица 3.3.1– Влияние времени на ферментативный гидролиз растительного масла
| Количество времени, ч | Среднее значение при 37 0С | Среднее значение при 45 0С |
| 1 час | 0,16 | 0,14 |
| 2 часа | 0,19 | 0,16 |
| 3 часа | 0,23 | 0,18 |
| 24 часа | 0,52 | 0,31 |
| 48 часов | 0,49 | 0,29 |
Изучение процесса ферментативного гидролиза касторового масла в маловодной системе с добавлением CaCl2в количестве 0,25 моль/л достигается наибольшая глубина гидролиза.
Таблица 3.3.2 Влияние добавления CaCl2на ферментативный гидролиз растительного масла
| Количество внесенного хлористого кальция | Среднее значение |
| 1 моль/л | 0,44 |
| 0,5 моль/л | 0,35 |
| 0,25 моль/л | 0,42 |
Таблица 3.3.3 Влияние перемешиванияна ферментативный гидролиз растительного масла
| Условия проведения процесса | Среднее значение | Среднее значение |
| 10 мкл фермента, 35 °С, 100 оборотов | 0,24 | 0,25 |
| 20 мкл фермента, 35 °С, 100 оборотов | 0,3 | 0,31 |
| 30 мкл фермента, 35 °С, 100 оборотов | 0,34 | 0,38 |
Анализ полученных данных показал, что использование водяной качалки не достаточно увеличил глубину гидролиза.
ВЫВОДЫ
1. Приведен анализ научно-исследовательской и патентной литературы по следующим темам: «Ферментативное преобразованием растительных масел с получением промышленных ценных продуктов».
Показано, что тема недостаточно освещена в российских литературных источниках, в зарубежных же источниках присутствует значительно больше материала по данной теме.
Составлен план литературного обзора. Написана первая глава.
2. Исследован гидролиз касторового масла ферментным препаратом«Novozym 435» в бездетергенной эмульсии.И показано, что в этих условиях препарат проявляет очень низкую активность
3. В результате исследований экспериментально определены оптимальные условия проведения процесса гидролиза касторового масла с применением в качестве катализатора ферментного препарата «Novozym 435»: температура 45 °С, период гидролиза – 24 часа, количество вносимого буферного раствора – 10 мкл.
4. В результате исследований экспериментально определены оптимальные условия проведения процесса гидролиза касторового масла с применением в качестве катализатора ферментного препарата «LipozymeTLIM»: температура 45 °С, период гидролиза – 24 часа, количество буферного раствора – 30 мкл. Положительный эффект на протекание процесса наблюдается при увеличении содержания воды в системе до 2 %, что приводит к увеличению глубины гидролиза в 2,5 раза.
5. Экспериментально определены условия проведения процесса гидролиза касторового масла с применением в качестве катализатора ферментного препарата «LipozymeCalBi». Показано, что оптимальная температура проведения процесса 37 °С. Наиболее высокий выход целевого продукта наблюдается при проведении гидролиза в течение 24 часов.
6.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Козлов Л.В. "Биоорганическая химия", 1980, т.
