Описание метода капиллярного электрофореза и технологии определения карбогидрат-дефицитного трансферрина

Согласно вышеописанным критериям в качестве метода, наиболее подходящего для рутинных скрининговых исследований, был выбран метод капиллярного электрофореза в исполнении автоматических капиллярных систем Minicap или Capillarys производства Sebia и наборов реагентов к ним.

Данный метод основан на разделении заряженных молекул в жидкой среде внутри сверхтонкого кварцевого капилляра под действием электрического тока. Белковые молекулы при этом разделяются согласно своему электрическому заряду. На разделение также оказывают влияние рН электролита и электроэндоосмотический поток. Метод не требует предварительной обработки образцов и позволяет осуществлять как качественную, так и количественную оценку фракций трансферрина. Расчетная формула CDT полностью соответствует текущему определению аналита (суммарное значение углевод-дефицитных фракций трансферрина), и одновременно с этим программное обеспечение прибора дает возможность производить количественную оценку каждой карбогидрат-дефицитной фракции в отдельности, что позволит использовать данные системы после утверждения международных рекомендаций по стандартизации CDT без каких-либо ограничений [13, 14].

Разделение изоформ трансферрина методом капиллярного электрофореза основано на разнице их электрического заряда, величина которого прямо пропорциональна количеству остатков сиаловой кислоты. Аналитический этап на системах Capillarys/ Minicap полностью автоматизирован и включает в себя разведение образца и его инъекцию в анодную часть капилляра. Под действием высокого напряжения образец, мигрируя по всей длине капилляра, разделяется на фракции, каждая из которых, достигая катодной части капилляра, последовательно регистрируется путем измерения поглощения пептидных связей, определяемого при 200 нм. Детекция изоформ трансферрина осуществляется в следующем порядке: асиало-, дисиало-, трисиало-, тетрасиало- и пентасиалотрансферрин. После завершения миграции капилляры немедленно промываются моющим раствором и подготавливаются к разделению следующего образца, заполняясь буфером для электрофореза [10, 12].

После детекции результаты обрабатываются программным обеспечением прибора и отображаются на экране монитора в виде процентного содержания фракций (количественный анализ) и денситометрической кривой (качественный анализ) (Приложение 5, Пример 1). Результаты качественной и количественной оценки импортируются в протокол исследования, служащий приложением к заключению о результатах анализа (Приложение 6).

Оборудование и тест-системы для капиллярного электрофореза Sebia

В качестве систем для определения карбогидрат-дефицитного трансферрина могут использоваться оба варианта анализаторов капиллярного электрофореза - Minicap или Capillarys и наборы реагентов к ним (Приложение 3).

Оба анализатора идентичны по принципу действия и отличаются только своей пропускной способностью [13, 14].

Система Capillarys имеет 8 встроенных капилляров, функционирующих параллельно, позволяя выполнять 8 анализов по определению уровня CDT одновременно. Пропускная способность системы Capillarys составляет 38 образцов в час, благодаря чему она может быть рекомендована для оснащения крупных скрининговых центров, выполняющих от 50-100 анализов CDT в день.

Система Minicap имеет 2 встроенных капилляра, функционирующих параллельно, позволяя выполнять 2 анализа по определению уровня CDT одновременно. Пропускная способность системы Minicap составляет 10 образцов в час, что оптимально для лабораторий со средним потоком CDT исследований – 20-50 тестов в день.

Перечень реагентов и расходных материалов для определения маркера CDT на приборах Capillarys и Minicap приведен в Приложении 3.

Системы Capillarys/ Minicap обеспечивают полную автоматизацию аналитического этапа, высокую пропускную способность, возможность проведения анализа из первичной пробирки и использование функции считывания штрих-кода. Программное обеспечение систем полностью русифицировано и позволяет хранить и обрабатывать большие массивы данных.

Аналитические характеристики метода Sebia подтверждены в испытаниях на статистически достоверной выборке российской популяции, проведенных в ГУЗ МНПЦ в период с 2011 по 2012 гг., а также в крупном популяционном исследовании российской выборки в рамках международного исследования, опубликованного в статье “Comparative performance of biomarkers of alcohol consumption in a population sample of working-aged men in Russia: the Izhevsk Family Study” группой авторов из Лондонской школы гигиены и тропической медицины Лондонского Университета, Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Ижевской государственной медицинской академии, Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова и Департамента лабораторной медицины Каролинского института [1, 97].

 Системы капиллярного электрофореза Capillarys/ Minicap, наборы реагентов и расходные материалы к ним зарегистрированы как изделия медицинского назначения и разрешены к использованию для in vitro диагностики на территории Российской Федерации.