Выделение рибонуклеопротеинов из дрожжей и их анализ

(4 часа)

 

Дрожжи, являющиеся в данной работе источником рибонуклеипротеина, содержат большое количество свободных углеводов, фосфата и простых белков. Поэтому прежде чем изучить состав нуклеопротеинов дрожжей, нужно выделить из них очищенный нуклеопротеин.

Выделение рибонуклеопротеинов.  В химическую пробирку помещают 8 г прессованных дрожжей и, проверив, что в лаборатории погашены все горелки и нет включенных электроплиток, добавляют 2-4 мл эфира для разрушения клеточных оболочек. Содержимое пробирки растирают стеклянной палочкой. Эфир разрушает оболочки дрожжевых клеток, после чего нуклеопротеины можно извлечь раствором гидроксида натрия.

В пробирку добавляют 5 мл 0,1н раствора гидроксида натрия и перемешивают содержимое стеклянной палочкой. Через 20 мин экстракт, содержащий нуклеопротеины, отделяют фильтрованием через бумажный фильтр в центрифужную пробирку с делениями. Если фильтрование идет медленно, в воронку добавляют несколько мл 0,1н раствора гидроксида натрия. Отфильтровав 3-4 мл экстракта, добавляют к нему двойной объем 3% уксусной кислоты. При этом нуклеопротеины выпадают в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, предварительно уравновесив пробирки.

После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок нуклеопротеинов промывают уксусной кислотой. Для этого в пробирку наливают 3% уксусную кислоту до метки 5 мл, осадок размешивают стеклянной палочкой и, уравновесив пробирки, отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают. Промывку повторяют еще 2-3 раза.

Гидролиз рибонуклеопротеинов. В широкую пробирку для гидролиза помещают осадок нуклеопротеинов и 4 мл 10% раствора серной кислоты. Пробирку закрывают пробкой, в которую вставлен обратный холодильник, и ставят на песчаную баню или асбестовую сетку газовой горелки.

Через 1 ч после начала кипения жидкости гидролиз прекращают, к остывшему гидролизату для нейтрализации прибавляют по каплям 10% раствор гидроксида натрия. Гидролизат фильтруют через бумажный фильтр. В фильтрате открывают продукты гидролиза нуклеопротеинов.

Реакции на компоненты нуклеопротеинов в гидролизате дрожжей.

1.Биуретовая реакция на полипептиды. К 5 каплям гидролизата дрожжей добавляют 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди (11). Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

2.Серебряная проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют 5 капель 1% раствора нитрата серебра. При стоянии через 3-5 мин выпадает небольшой рыхлый осадок серебряных соединений пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенных в бурый цвет.

3.Проба на рибозу и дезоксирибозу.  К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель реактива Фелинга. Жидкость перемешивают и верхний слой ее нагревают до начала кипения. Выпадает красный осадок оксида меди (1) вследствие окисления рибозы и восстановления Cu(ОН)₂ до Cu₂О.

4. Обнаружение дезоксирибозы дифениламиновым реактивом. В пробирку вносят 5-10 капель гидролизата нуклеопротеинов, добавляют в два раза больший объем дифениламинового реактива, перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на 5-10 мин. Жидкость постепенно приобретает синее окрашивание, обусловленное реакцией дифениламина с дезоксирибозой.

5. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 20 каплям молибденового реактива (раствор молибдата аммония в азотной кислоте) добавляют 2-3 капли гидролизата и кипятят несколько минут на открытом огне. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорно-молибденового аммония.

 

Исследуемый материал:  прессованные дрожжи, 0,08% раствор ДНК

Реактивы:  прессованные дрожжи, этиловый эфир, 3% раствор уксусной кислоты, 10% раствор серной кислоты, дифениламиновый реактив, 0,1н и 10% растворы гидроксида натрия, реактив Фелинга, молибденовый реактив, 1% раствор сульфата меди, водный раствор аммиака, 1% раствор нитрата серебра.

 Оборудование

1.Центрифуга.

2. Водяная баня.

3. Термостат.

4. Вискозиметр.

5. Секундомер.

6. Пробирки.

7. Пипетки.

 

Получение и культивирование каллусной ткани из корнеплодов моркови

Образование каллуса происходит в области первичных или вторичных меристем, а также из паренхимы, прилегающей к этим меристемам или вторичным сосудистым тканям. Инициация каллуса из паренхимы или камбия активируется наличием в экспланте зрелой сосудистой ткани. Процесс каллусообразования зависит от размера экспланта. Чем он крупнее, тем разнообразнее набор клеток. Первичный эксплант обычно имеет размер 5-10 мм³ и массу 20-100 мг.

Ход работы

Отобрать здоровые корнеплоды моркови, тщательно вымыть щеткой с мылом, затем отмыть водопроводной водой и погрузить для стерилизации в 96%-ный этанол и на 5 минут без дальнейшей отмывки стерильной водой.

В стерильных условиях отрезать верхнюю часть корнеплода моркови и стерильным пробкобуром извлечь цилиндры из ткани. Эксплант корнеплода моркови должен содержать ксилемму, флоэмную паренхиму и камбий.

Вычлененные цилиндры поместить в стерильную чашку Петри и разрезать на диски шириной 1-2 мм, сделать надсечки и перенести с помощью пинцета на питательную среду М-С, содержащую 2,4-Д и кинетин. Культивировать в термостате при температуре 25°С. Через три недели рассмотреть каллусную ткань.

 

Исследуемый материал: корнеплод моркови

Реактивы: стерильная питательная среда М-С с добавлением 2 мг 2,4-Д и 0,2 мг кинетина на 1 л, стерильные листы бумаги.

Оборудование

1) Пробкобуры.

2) Стерильный скальпель.

3) Стерильный пинцет.

4) Стерильная чашка Петри.

.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Блинов, В.А. Общая биотехнология (методические указания) / В.А. Блинов, С.Н. Буршина. – Саратов: «Полиграфия Поволжья», 2004. – с. 17-19.

2. Коростелева, Н.И. Биотехнология: учебное пособие/ Н.И. Коростелева, Т.В. Громова, И.Г. Жукова. – Барнаул: Изд-во АГАУ, 2006. – с. 116.