Examenul morfologic al spermilor

În sperma reproducătorilor domestici se întâlnesc frecvent, în proporţii variabile, spermi cu diferite anomalii (teratologici), precum şi spermi imaturi, care pot influenţa negativ fecunditatea, când procentul acestora depăşeşte anumite limite. Pentru acest motiv, examenul spermei trebuie completat şi cu determinarea raportului de spermi teratologici şi imaturi.

Anomaliile morfologice ale gameţilor se pot încadra în:

- anomalii primare, determinate de tulburarea spermiogenezei, având o localizare în tubii seminiferi, până la ajungerea în epididim şi constau în alterarea morfologică şi structurală a capului spermului;

- anomalii secundare, care se produc în epididim datorită stagnării prelugite la acest nivel, sau sunt efecte ale acţiunii unor factori termici (şocul termic), chimici sau mecanici din timpul ejaculării şi manipulării spermei. Anomaliile secundare vizează alterarea piesei intermediare sau a cozii gameţilor.

Anomaliile capului pot fi de formă şi mărime şi se referă la micro- şi macrocefalie, spermi cu capul dublu sau multiplu, cap alungit şi îngust, în formă de pară, neregulat şi mic – sferic. Alte anomalii ale capului spermului constau în cap detaşat (liber) şi invaginarea învelişului nuclear.

Anomaliile acrozomului se referă la: acrozom aplatizat, incomplet, curbat sau detaşat.

Piesele intermediare anormale pot fi: îngroşate, răsucite, cu noduri duble, gât filiform şi cu picătura protoplasmatică proximală sau distală. În procesul maturării epididimare a spermilor picăturile protoplasmatice migrează de la gât spre extremitatea distală a piesei intermediare şi dispare de regulă înaintea ejaculării; această migrare a picăturii protoplasmatice se realizează în capul epididimului. Într-un ejaculat normal, procentul spermilor cu picătura protoplasmatică (imaturi) nu trebuie să depăşească 2-3% la berbec şi taur şi 10% la vier şi armăsar. Depăşirea acestui procent denotă epiuizarea sexuală a masculilor.

Afecţiunile epididimului alterează conformaţia normală a piesei intermediare, fapt care reduce mobilitatea spermilor şi se asociază cu infecunditatea.

Examenul morfologic al spermilor poate depista unele forme de anomalii ale cozii: cozi duble sau răsucite, scurte sau absente, picături protoplasmatice localizate proximal sau distal.

După datele din literatura de specialitate, procentul maxim de spermi anormali (teratologici) admişi în sperma de taur este de 18%, inclusiv 3-4% cu anomalii ale capului, 4-10% - la piesa intermediară şi 0,5-2% - la coada spermului.

Berbecii cu o fecunditate normală nu depăşesc 14% incidenţă a spermilor anormali; vierii şi armăsarii au în medie 20% de spermi teratologici.

Determinarea spermilor anormali se face prin utilizarea diferitor metode de colorare, care permit atât aprecierea de ansamblu a gameţilor, cât şi anumitelor aspecte legate de structura lor. Determinarea spermilor cu anomalii primare sau secundare sau a celor imaturi, se poate face prin efectuarea unor frotiuri din spermă, care apoi se colorează cu: Giemsa rapid, fuxină Pfeiffer, soluţie albastru de metilen 1%, eozină 5%, hematoxilină etc.

Din sperma proaspăt recoltată se prepară mai multe frotiuri, care se fixează prin uscare la aer sau în alcool 96°, timp de 2 minute. După fixare se procedează la colorarea cu o soluţie din cele menţionate timp de 3-5 minute. Frotiurile colorate se spală sub un jet mic de apă, se usucă şi apoi se examinează la microscop cu putere de mărire de 200-400 ori. În timpul examenului microscopic se notează separat numărul de spermi normali şi al celor cu anomalii, până se examinează cca 500 spermi. Pe baza numărului de spermi examinaţi se calculează proporţia dintre cei anormali şi normali.

Determinarea proporţiei de spermi vii şi morţi

Se poate realiza printr-o coloraţie intravitală, compusă din 3 gr citrat de sodiu, 100 ml apă distilată, 1 gr eozină şi 5 gr negrozină. Membrana celulară a spermilor morţi devine permeabilă la eozină, astfel că aceştia se colorează în roşu, în comparaţie cu spermii vii, care rămân necoloraţi.

Calculul acestei proporţii rezultă din numărarea a 100-500 celule spermatice şi exprimarea procentuală a gameţilor vii şi morţi dintr-un ejaculat.

Teste biochimice pentru aprecierea calităţii spermei

În practica însămânţărilor artificiale, testele biochimice sunt puţin folosite, totuşi cu valoare de diagnostic sunt: testele de rezistenţă termică, rezistenţa la soluţii hipertonice şi testul reducerii albastrului de metilen.

Proba biologică

Rolul hotărâtor în analiza spermei îl are aprecierea fecundităţii spermilor, realizată prin proba biologică. Concepţia (fecunditatea) depinde de gradul de înrudire al femelei cu masculul, de starea sănătăţii reproducătorilor (femelei şi masculului), condiţiile de alimentaţie şi întreţinere etc. De aceea, pentru aprecierea fecundităţii unui reproducător se alege un grup de femele tinere, nulipare, cu stare de sănătate perfectă, care se montează sau se însămânţează artificial cu sperma masculului respectiv. După numărul femelelor devenite gestante se fac concluzii asupra capacităţii de fecundare a reproducătorului. Astfel, se consideră normală sperma unui reproducător care realizează instalarea gestaţiei, după prima însămânţare, la 70-75% din femele.

Diluarea spermei

Diluarea şi conservarea materialului seminal sunt operaţii prin care se asigură menţinerea viabilităţii şi puterii fecundative a spermilor un timp variabil în afara căilor genitale.

Practicarea însămânţărilor artificiale arată că într-un diluant bine pregătit şi ales spermii îşi păstrează viabilitatea şi celelalte însuşiri biologice un timp mai mult mai îndelungat decât în mediul natural. Aceasta se explică prin următoarele.

În primul rând, plasma seminală, constituită din secreţiile anexelor testiculare şi ale glandelor anexe ale aparatului genital nu serveşte ca mediu ideal pentru păstrarea spermilor în afara organismului. Secreţia slab alcalină a prostatei stimulează mobilitatea spermiilor, care până la acest moment se aflau în canalul epididimar, în stare de anabioză. Acest fenomen este important pentru a asigura înaintarea spermilor prin căile genitale femele şi fecundarea normală a ovulelor. Însă, activarea mobilităţii şi menţinerea viabilităţii spermilor de către produsul de secreţie al glandelor anexe este însoţită de distrugerea tegumentului lipoproteic al spermilor sub acţiunea ionilor de Na⁺ şi K^-, care se conţin în plasma seminală. Ionii de Na⁺ şi alte metale neutralizează încărcătura electrică negativă a spermilor şi provoacă aglutinarea lor.

Altă cauză care duce la peirea spermilor în afara organismului este diminuarea resurselor energetice pentru metabolismul celulelor spermatice şi, în primul rând, al zaharurilor. Glucoza este considerată sursă principală de energie a spermilor atât în mediu aerob, cât şi în cel aerob. La sperma cu o concentraţie ridicată şi bogată în fructoză (taur, berbec) se constată diminuarea într-un timp foarte scurt a pH-ului rezultat din acumularea acidului lactic, deci din fructoliză. Ritmul creşterii acidităţii după ejaculare are o semnificaţie importantă; acidul lactic acţionează negativ asupra spermilor, iar concentraţiile mari îi omoară. Scăderea sau absenţa sarcinii electrice, care are loc mai ales în urma acidifierii mediului, este urmată, de asemenea, de aglutinarea spermilor.

Unul din factorii importanţi ai mediului care acţionează asupra spermilor este temperatura. La coborâre bruscă, mai ales sub +18°C spermii sunt supuşi şocului termic şi mor.

Prin urmare, cauzele concrete care duc la peirea spermilor în afara căilor genitale sunt:

· subnutriţia spermilor ca urmare a epuizării rezervelor energetice din gameţi şi plasma seminală;

· intoxicaţia spermilor cu produsele metabolice;

· deteriorarea tegumentului lipoproteic, exfolierea membranei celulei spermatice şi pierderea sarcinii electrice negative datorită acumulării în plasma seminală a acidului lactic;

· acţiunea negativă asupra spermilor a bacteriotoxinelor şi bacteriolizinelor;

· variaţiile de temperatură care provoacă şocul termic.

De aceea, pentru prelungirea viabilităţii spermilor în afara organismului se impune:

· reducerea activităţii cinetice a celulelor spermatice;

· asigurarea gameţilor cu substanţe nutritive;

· protejarea spermilor de distrugerea tegumentului lipoproteic şi al membranei celulei spermatice;

· diminuarea intoxicaţiei spermilor prin diluarea plasmei seminale.

Toate aceste condiţii le asigură mediile de diluţie care conţin ingridienţi cu proprietăţi protectoare, nutritive, neutralizante etc.

În afară de asigurarea mediilor favorabile pentru prelungirea viabilităţii spermilor «in vitro», diluarea spermei urmăreşte şi alte obiective, printre care: creşterea volumului total al ejaculatului şi posibilitatea de a însămânţa un număr cât mai mare de femele dintr-un ejaculat.

Principiul ştiinţific care stă la baza diluării spermei este acela că din numărul total de spermi depuşi de un mascul în căile genitale feminine prin montă, numai un procent mic de spermi (la taur circa 5%) participă la fecundarea ovulului, iar restul mor. În practică s-a demonstrat că pentru a obţine o rată normală de fecundare la vacă spre exemplu, pentru însămânţare sunt necesare într-o doză de spermă diluată, 12-25 milioane de spermi vii, însă conform cercetărilor mai recente, numai 10 mln şi chiar 5 milioane de gameţi. Rezultă că la stabilirea gradului de diluţie a materialului seminal trebuie să se rezerveze, pentru o doză de inoculare, un minim de 10-12 milioane de spermi cu mişcări active de înaintare.

Se admit pentru diluare şi conservare numai ejaculatele care se încadrează în anumiţi parametri, în funcţie de specie, aşa cum rezultă din tabelul următor.

Valorile medii şi minimale ale principalelor însuşiri ale spermei admise pentru diluare

Specia	Volumul ejaculatului (ml)		Concentraţia spermei (miliarde spermi/ml)		Mobilitatea spermilor (puncte)		Procentul maxim de spermi anormali
	Media	Minim admisibil	Media	Minim admisibil	Media	Minim admisibil
Taur	4,0	3,0	1,2	0,6	9	8	18
Berbec	1,0	0,6	3,0	2,0	9	8	14
Armăsar	75,0	40,0	0,12	0,05	6-7	5	20
Vier	250,0	150,0	0,15	0,1	7-8	7	20

Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un diluant pentru conservarea spermei

Menţinerea fecundităţii unei sperme un timp mai îndelungat după recoltare este în funcţie de calitatea diluantului şi metoda de conservare.

În procesul de prelucrare a materialului seminal se utilizează soluţii diluante, care trebuie să întrunească următoarele proprietăţi:

· să fie izoterme – temperatura soluţiei diluante, a sticlăriei diverse cu care sperma intră în contact în timpul procesului trebuie să aibă valori apropiate, evitându-se astfel deteriorarea mobilităţii prin şoc termic;

· să fie izoterme cu sperma – presiunea osmotică adecvată a diluantului se reglează prin echilibrarea cantitativă a ingredienţilor; citratul de sodiu realizează un mediu izotonic cu sperma;

· să aibă un pH apropiat de cel al plasmei seminale (6,2-6,8 pentru sperma de taur şi berbec şi 7,0-7,2 pentru cea de vier şi armăsar);

· să conţină substanţe nutritive pentru spermi; adaosul de glucoză, fructoză sau alte hexoze la diluant reprezintă substratul energetic pentru metabolismul anaerob al celulelor spermatice; alături de alte ingrediente, acestea permit prelungirea semnificativă a duratei de viaţă a spermilor. Fosfolipidele din lapte, lecitina şi lipoproteinele din gălbenuşul de ou reprezintă componentele nutritive şi spermioprotectoare.

Tot în gălbenuşul de ou se remarcă prezenţa triptofanului, tirozinei şi fenilalaninei, care au rol important în procesele de dezaminare oxidativă din spermă, iar colesterolul şi carotenul stimulează activitatea succinică, malică şi gliceroaldehid-3-fosfat-dehidrogenazică în spermi. Alţi compuşi din gălbenuş acţionează ca protectori ai enzimelor sulfhidrilice, servind în cadrul proceselor oxidative şi ca factori antiaglutinanţi în spermă;

· să conţină substanţe crioprotectoare – crioprotecţia este asigurată de glicerină, gălbenuşul de ou, lapte sau dimetilsulfoxid, substanţe care împiedică cristalizarea apei de constituţie şi pe această cale, deteriorarea ireversibilă a membranei celulare a spermilor în timpul congelării.

· să posede o acţiune bacteriostatică şi chiar bactericidă – adaosul de antibiotice sau sulfamide în concentraţii bacteriostatice împiedică multiplicarea microorganismelor din spermă, proces care determină elaborarea unor endo- şi exotoxine bacteriene, ambele extrem de toxice pentru celulele spermatice.

Apa din componenţa diluantului trebuie să fie distilată sau deionizată, deoarece ionii metalelor au un efect toxic asupra spermilor, în caz contrar se utilizează substanţe chelatoare, care complexează aceşti ioni.

Clasificarea diluanţilor pentru spermă

Clasificarea diluanţilor se face după următoarele criterii: compoziţie, scopul şi specia la care se utilizează.

După scopul în care sunt folosiţi diluanţii pot fi clasificaţi în felul următor:

· diluanţi pentru conservarea spermei la temperatura camerei;

· diluanţi pentru conservarea spermei prin refrigerare;

· diluanţi pentru conservarea spermei prin congelare.

În funcţie de compoziţie diluanţii se împart în următoarele grupe:

1 – diluanţi salini (cristaloizi). Se bazează pe folosirea substanţelor chimice (citraţi, fosfaţi, tartaţi, sulfaţi etc.) la care se adaugă gălbenuş de ou pentru protejarea spermilor de şocul termic şi glucide (glucoză, fructoză, lactoză etc.). La ora actuală diluanţii salini sunt cei mai utilizaţi pe plan mondial, încât ei prezintă 70% din numărul total, folosiţi la conservarea spermei. Exemplificăm câţiva diluanţi salini:

Diluanţi cu gălbenuş de ou

Apă distilată 100 ml

Citrat de sodiu + 2H₂O 2,9 grame

Gălbenuş de ou 20%

Se prepară soluţie salină din 29 grame citrat de sodiu şi 1 litru de apă bidistilată, apoi se sterilizează prin fierbere sau autoclavare. În ziua diluării spermei se adaugă 20% gălbenuş de ou proaspăt. La întregul diluant apoi se adaugă antibiotice: 1000 UI penicilină şi 500-1000 gama dehidrostreptomicină. Se pot folosi concentraţii diferite de citrat de sodiu: 3,2-3,6% în loc de 2,9 gr%.

Gălbenuş de ou citratat şi glucoză

Citrat de sodiu (Na₃C₆H₅O₇) cristalizat cu 2 H₂O                 1,15 gr

Glucoză anhidră                                                         3,00 gr

Apă distilată                                                               100,0 ml

Gălbenuş de ou                                                          20,0 ml

Gălbenuş de ou citratat şi fosfatat

Fosfat acid de potasiu (PO₄H₂K)                               0,2 gr

Fosfat acid de sodiu (PO₄HNa) cristalizat

cu 2 molecule de H₂O                                                2,0 gr

Apă distilată    ad.                                                 100 ml

După răcire se adaugă gălbenuş de ou                       20-25%

Gălbenuş de ou citratat cu glicerină

În diluantul cu gălbenuş de ou citratat se adaugă 2-10% glicerină pură. După 3 zile de conservare, acest diluant prezintă o fecundaţie mai bună decât a diluantului gălbenuş de ou citratat neglicerinat.

Diluantul TRIS cu gălbenuş de ou glicerinat, fructoză şi acid citric

Tris hidroximetil-aminometan                                    6,056 gr

Acid citric                                                                  3,0 gr

Fructoză                                                                     2,5 gr

Apă distilată                                                               166,320 gr

După prepararea soluţiei se încălzeşte la 90°C, apoi se răceşte şi se împarte în două jumătăţi egale. Înainte de folosirea uneia din părţi se adaugă 15,840 grame de apă bidistilată, 25 grame gălbenuş de ou proaspăt, 0,1 grame streptomicină şi 100000 UI penicilină G. La cealaltă parte a diluantului se adaugă 19,68 grame glicerină pro analisis, 25 grame gălbenuş de ou proaspăt, 0,1 grame streptomicină şi 100000 UI penicilină G; pH trebuie să fie ajustat la 6,85.