Система экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов

Первый шаг в конструировании рекомбинантного бакуловируса AcMNPV состоит в создании транспортного вектора. Транспортный вектор - это производная плазмиды E. coli, содержащая фрагмент ДНК AcMNPV (рис. 7.8). Кодирующая последовательность гена полиэдрина из этого фермента удалена.

Рис. 7.8. Схематическое представление единицы экспрессии транспортного вектора на основе бакуловирусов (AcMNPV). Ген белка-мишени встраивают в сайт клонирования (СК) между промотором гена полиэдрина (Рр) и сайтом терминации его транскрипции (Pt).

Культуру клеток насекомого, трансфицированную ДНК AcMNPV, трансфицируют затем транспортным вектором, несущим клонированный ген. В некоторых дважды трансфицированных клетках происходит двойной кроссинговер, в результате которого клонированный ген вместе с промотором и сигналом терминации транскрипции гена полиэдрина встраивается в ДНК AcMNPV (рис. 7.9), замещая ген полиэдрина. Вирионы, не содержащие этого гена, образуют зоны клеточного лизиса, из которых можно выделить рекомбинантный бакуловирус.

Рис. 7.9. Замещение гена полиэдрина AcMNPV единице и экспрессии транспортного вектора в результате двойного кроссинговера в 5'- и 3 '-фрагментах.

Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадии литического цикла, поместить ген lacZ E. coli., кодирующий ß-галактозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геном AcMNPV, то в присутствии хромогенного субстрата ß-галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет.

Гетерологичный белок, синтезируемый культурой клеток насекомого-хозяина, зараженной рекомбинантным бакуловирусом, можно выделять через 4—5 сут.

С помощью системы экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов уже получено более 500 различных гетерологичных белков, при этом более 95% из них имели правильные посттрансляционные модификации.

16. Охарактеризуйте экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитающих.

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих используются для изучения функций и регуляции генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые потенциально могут быть применимы в медицинских целях для лечения некоторых заболеваний человека. Уже сконструированные экспрессирующие векторы млекопитающих весьма многочисленны, но все они обладают сходными свойствами и похожи на другие эукариотические экспрессирующие векторы.

Полилинкер (ПЛ), представляющий собой множественный сайт клонирования, и селективный маркер (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра) или терминации. Обычно используют регуляторные последовательности ДНК вирусов животных (например, цитомегаловируса человека, SV40 или HSV) или генов млекопитающих (гена β-актина, металлотионеина, тимидинкиназы или гена гормона роста). Репликация в клетках E.coli и в клетках млекопитающих обеспечивается соответствующими сайтами инициации репликации: ori плазмиды colEI и, например, обезьяньего вируса 40 (SV40). Для отбора трансформированных клеток E.coli используется ген устойчивости к ампициллину Amp.

В качестве селективных маркеров для трансфицированных клеток млекопитающих используют разные гены:

1. Бактериальный ген Neo, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, которая обеспечивает устойчивость трансфецированных клеток к токсичному соединению генетицин (G-418), блокирующее трансляцию в нетрансфицированных клетках млекопитающих.

2. Ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР). В этой системе используют клетки с дефектом гена ДГФР, которые не способны расти на среде с метотрексатом. Отобранные клетки пересевают на среды с большей концентрацией метотрексата, отбирая, таким образом, более устойчивые клетки, т.е. содержащие больше копий вектора.

3. Ген фермента глутаминсинтетазы (GS), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому действию метионинсульфоксимина. Вектор, содержащий GS- ген,вводят в культуру клеток млекопитающих и для отбора клеток, несущих большое количество копий вектора, повышают концентрацию метионинсульфоксимина в среде. При этом в хозяйских клетках тоже должна присутствовать GS, поскольку только множественные копии GS-гена могут обеспечивать устойчивость к метионинсульфоксимину.

17. Опишите, какие задачи можно решать при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза; объясните преимущества и недостатки использования ДНК фага М13, плазмидной ДНК, ПЦР-амплификации.

Олигонуклеотид-направленный (сайт-специфический) мутагенез — это один из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген. Для его осуществления необходимо знать: 1) точную нуклеотидную последовательность той области ДНК, которая соответствует мРНК-кодону, подлежащему изменению; 2) характер аминокислотных замен.

Обычно встраивают ген-мишень в двухцепочечную форму вектора на основе бактериофага M13.

Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора (плюс-цепь M13) и смешивают ее с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплементарным — за исключением одного нуклеотида -- нужному сегменту клонированного гена. Этот отличающийся (т. е. неспаривающийся) нуклеотид соответствует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить.
Олигонуклеотид будет гибридизоваться с комплементарным участком клонированного гена в том случае, если: 1) он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК М13; 2) неспаривающийся нуклеотид находится примерно посередине олигонуклеотида; 3) отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе. 3'-конец спарившегося олигонуклеотида служит затравкой для инициации синтеза ДНК, а интактная цепь ДНК M13 — матрицей. Репликация осуществляется с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Escherichiacoli при наличии в среде четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов«а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи к 5'-концу затравки обеспечивает ДНК-лигаза фага Т4. Однако in vitro синтез ДНК редко идет до конца, и частично двухцепочечные молекулы приходится отделять от нормальных центрифугированием в градиенте сахарозы.

Полностью двухцепочечными молекулами ДНКфага М13, содержащими, однако, некомплементарные нуклеотиды, трансформируют клетки Е. coll. В последних образуются фаговые частицы, что в конечном счете приводит к лизису клеток и образованию бляшек. Поскольку репликация идет по полуконсервативному механизму, половина популяции образующихся фаговых частиц должна содержать ДНК дикого типа, а половина — мутантную ДНК со специфической нуклеотидной заменой. Частицы, содержащие только мутантный ген, идентифицируют при помощи ДНК-гибридизации в жестких условиях, используя в качестве зонда исходный олигонуклеотид. Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспрессирующий Е. соli -вектор. Мутантный белок синтезируют в E. coli и очищают.