Опишите стратегию выделения и клонирования генов эндонуклеаз в клетках бактерии E.coli для получения коммерческих препаратов рестриктаз

Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты: они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты: эндонуклеазы рестрикции у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной.
Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы.
Cтратегия выделения и клонирования в Е. coli гена рестриктазы Pstl грамотрицательной бактерии Providencia stuartii:

1. ДНК P, stuartii расщепляют с помощью Hin dIII и встраивают фрагменты в Hin dIII - сайт плазмиды pBR322.

2. Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки E. соli НВ101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом λ. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа λ, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой.

3. Трансформированные клетки, устойчивые к фагу λ, подвергают осмотическому шоку, чтобы высвободить периплазматические белки. Определяют активность рестриктазы Pst I в белковом экстракте.

4. Положительные клоны тестируют на наличие Pst I-метилирующей активности.

Для выделения генов, кодирующих ферменты рестрикции и модификации (метилирования), можно использовать также другой подход, который состоит в следующем,

1. Создают банк клонов ДНК организма-донора, продуцирующего известную эндонуклеазу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавания для этой рестриктазы.

2. Трансформируют Е. colt гибридными плазмидами.

3. Из трансформированных клеток, выросших в жидкой селективной среде (т. е. из клеток, содержащих плазмиду), выделяют плазмиднуюДНК.

4. Обрабатывают ее интересующей исследователя эндонуклеазой рестрикции,

5. Трансформируют Е. coli плазмидными ДНК, обработанными эндонуклеазой рестрикции.

Ключевым моментом этого метода является то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы.