Проанализируйте перспективы получения иммунотоксинов

Так, ответ взял из мед бт!

Иммунотоксин — конъюгат цитотоксического вещества и средства его направленной доставки к клеткам-мишеням.

Обычно И. — химерный белок, состоящий из двух доменов, один из которых обладает свойствами Антитела, а другой — свойствами Токсина. Первый домен обеспечивает связывание химерного белка со специфической молекулой или клеткой, а второй инактивирует молекулу-мишень или убивает клетку. И. используется для направленного переноса фармакологических агентов к больным клеткам и их селективного уничтожения. Чаще всего в качестве токсического агента в И. служат растительные белки рицин и вискумин, а также дифтерийный токсин А.

В качестве мишеней рассматривают:

· клетки опухоли

· гипертрофированные субпопуляции лимфоцитов или других клеток.

· клетки, пораженные внутриклеточными паразитами (микробами, вируса­ми и др.).

Основанием для этого служит посылка, что иммунитет к таким болезням базируется на уничтожении клеток-продуцентов паразитов и что эти клетки имеют на своей поверхности специфические маркеры — фраг­менты антигенов возбудителя. Поэтому использование молекул, способ­ных специфически присоединиться к пораженной клетке и уничтожить ее, представляется весьма перспективным с терапевтической точки зрения.

Существует два основных способа получения активных высокоспецифических конъюгатов
В одном случае антитела (AT) конъюгируют с целым токсином, в другой - с его ферментативной частью.

Моноклональные антитела обрабатывают бифункциональным реагентом N-сукцинимидил-З (2 пиридилдитио) пропионатом (СПДП). На молекулу иммуноглобулина вводили 3-4 пиридилдисульфидные группы. К препарату РТА добавляли до ЮмМ дитиотреитола и после гель-фильтрации на Сефадексе G25 смешивали с модифицированными антителами. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре в течении 12 ч. Конъюгат отделяли от непрореагировавших молекул антител и А-субъединиц токсина с помощью гельфильтрации на колонке Spherogel TSK 3000SW в системе HPLC.

Определение способности МА и иммунотоксинов активирооатвать систему комплемента:

Предварительно снятые и отмытые клетки инкубировали 30 минут при 37°С, в 50 мкл. раствора, содержащего 150 мкг./мл. иммунотоксина или МА в ФСБ. Затем клетки трижды отмывали центрифугированием в 0,1 М растворе ФСБ. Клетки ресуспендировали 100 мкл. 2% раствора кроличьей сыворотки в ФСБ. Инкубировали 3 мин. при 37°С. Выживаемость клеток определяли по исключению трипанового синего.

 РИЦИН

Иммунотоксины изучаются как препараты с противораковыми свойствами и открывают новую главу в борьбе с онкологичес­кими заболеваниями.

Наиболее полно экспериментально доказано использование в качестве противоракового токсина препарата рицина — белка, выделенного из клещевины.

Рицин состоит из двух субъединиц — А и В, соединенных ковалентно.

 Противораковый эффект достигается следующим образом: цепь В соединяется с поверхностными гликопротеинами клеток и обеспечивает их проницаемость, где в цитоплазме частица А освобождается, ингибирует синтез белка в рибосомах и приводит клетку к гибели. Однако этот эффект не несет противораковой направленности. Последняя достигается тем; что к субъединице А присоединяются в качестве вектора моноклональные противораковые антитела, которые направленно транспортируют этот комплекс к раковой клетке.

Наиболее хорошо изучен дифтерийный токсин (ДТ), синтезируемый патогенной бактерией Corynebacterium diphtheriae.

ü Первоначально токсин производится в неактивной форме (про-токсин),

ü  затем после специфичного эндопротеазного расщепления белок распадается на две функционально и иммунохимически различные субъединицы — А (21 кДа) и Б (39 кДа).

ü  При этом происходят значительные изменения во вторичной структуре полипептидов, обеспечивающие появление специфичных свойств токсина (часто этот процесс называют активацией токсина).

ü Токсический эффект обусловлен действием N-концевой субъединицы А, которая обладает NAD-гликогидролазной и ADP-рибозилтранс- феразной активностями.

ü В результате катализи­руемых этим ферментом реакций происходит специфическая инактивация эукариотического фактора элонгации EF-2, после чего тот теряет способность связываться с рибосомами 80S и, следовательно, участвовать в биосинтезе белка.

ü В основе молекулярного механизма инактива­ции EF-2 лежат две ферментативные реакции, которые катализируются субъединицей А дифте­рийного токсина после проникновения его в ци­топлазму эукариотической клетки.

Создание иммунотоксинов — это новый современный подход в фармакологии. Препараты данного типа могут быть очень эффективны при терапии опухолей, модуляции иммунного ответа и др. Однако первоначально разработанный метод довольно трудоемкий и, кроме того, не обеспечивает стандартности иммунотоксина: необходимо выделять А-субъединицу токси­на, целевой белок, обеспечивающий связыва­ние с определенными рецепторами, затем осу­ществлять конъюгацию этих компонентов че­рез дисульфидную связь. Преодолеть данное затруднение удалось Дж. Марфи с соавторами (1983-1988 гг.), выполнившим серию генно-инженерных работ по созданию химерных токсинов. Прежде всего был клонирован фрагмент ДНК, содержащий промотор и последовательность, кодирующую сигнальный пептид и А-субъединицу дифте­рийного токсина. Получен штамм Е. coli, про­дуцирующий гибридный белок и секретирующий его в периплазматическое пространство клеток. Затем был сконструирован гибридный ген дифтерийного токсина, у которого З'-концевой участок, кодирующий рецепторсвязываю- щий домен Б, заменен на синтетический ген-эквивалент меланоцитстимулирующего гормона а человека