Основные методы традиционной селекции: родственная гибридизация, отдаленная гибридизация, экспериментальный мутагенез
В основе традиционной селекции лежит поиск оптимального сочетания в одном организме генов, полученных от разных родительских форм. В этих целях проводят гибридизацию различных сортов или селекционных линий одного вида, обладающих какими-либо ценными признаками. Чем выше генетическая изменчивость внутри, тем, выше эффективность селекции.
Но есть виды сельскохозяйственных растений, у которых естественная внутривидовая изменчивость невысока (например, свекла). Многие ценные гены у видов культурных растений могут отсутствовать совсем (например, гены устойчивости к некоторым болезням). Поэтому в селекции получили широкое распространение методы, направленные на расширение генетического разнообразия вида с помощью экспериментального мутагенеза и отдаленной гибридизации. [2, 5]
Отдаленная гибридизация между культурными растениями и родственными дикими видами позволяет не только расширить генетическую изменчивость культурного вида, но, что наиболее важно, и привнести отдельные ценные гены от дикого вида, отсутствующие у культурного вида. Подобные скрещивания обычно являются весьма сложным делом, поскольку между видами существуют жесткие репродуктивные барьеры (невозможность развития пыльцы чужого вида, образование не жизнеспособных семян, образование фертильных семян).
|
|
Между видами существуют также жесткие барьеры, затрудняющие естественную рекомбинацию. Это означает, что хромосомы межвидового гибрида, полученные от разных видов, могут отличаться по количеству и гомологии (сходству). Отсутствие гомологии между хромосомами приводит к тому, что они не способны сближаться и обмениваться отдельными участками (а следовательно, и отдельными генами) в процессе образования половых клеток. В результате становится невозможным перенос нужных генов от дикого вида в генетический материал культурного вида. Поэтому отдаленная гибридизация может быть эффективна только в том случае, когда скрещиваются относительно близкие в эволюционном отношении виды. [5]
Проблема отсутствия рекомбинации у отдаленных гибридов может быть решена посредством удвоения у них количества хромосом. В этом случае каждая хромосома получит себе пару, и процесс образования половых клеток будет протекать нормально. Такие гибриды, объединяющие в своем геноме полные (т.е. двойные) наборы хромосом разных видов (их называют амфидиплоидами), широко распространены в природе. Наиболее известные из них - пшеница, слива. Селекционер, задумавший получить амфидиплоид с участием культурного и дикого вида, должен учитывать, что у этого гибрида помимо селекционно-ценных генов дикого вида будет присутствовать и полный набор нежелательных "дикарских" генов. Избавиться от них можно только путем возвратных скрещиваний с культурным видом, в ходе чего геном дикого вида замещается культурным и лишь отдельные ценные гены дикого вида сохраняются благодаря селекции. Однако эта процедура может быть эффективной только в случае относительно высокой гомологии хромосом скрещиваемых видов (то есть они должны быть относительно близкородственными). Круг замкнулся. Не случайно поэтому единственным амфидиплоидом, представляющим селекционную ценность из числа полученных искусственно, остается тритикале - гибрид между двумя культурными видами: пшеницей и рожью. [6, 7]
|
|
В случае экспериментального мутагенеза организм подвергается действию факторов, вызывающих различные нарушения в структуре ДНК: радиации, обработке химическими веществами, обладающими мутагенной активностью. Большинство индуцированных таким образом нарушений имеет неблагоприятные последствия для организма. Однако отдельные мутации могут быть весьма полезны с селекционной точки зрения.
Генная инженерия
Генетическая инженерия - это технология получения новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства.
Первый этап создания генно-инженерных организмов - выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам. Для этого из организмов, обладающих такими генами, с помощью специальных химических методов выделяют нуклеиновые кислоты и разрезают их на отдельные фрагменты, используя наборы ферментов - рестриктаз.
В 1973 году получена первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК.Г. Бойер и С. Коэн (США) сумели "пришить" к плазмиде E. coli фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать в клетках E. coli, размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью человека. Это означало, что таким образом можно получать многочисленные копии любых генов, то есть клонировать гены, нарабатывать требуемые для последующих манипуляций объемы генетического материала. В генетической инженерии в настоящее время используют различные микроорганизмы для клонирования генов, но чаще всего для этой цели привлекают хорошо изученную бактерию пищеварительного тракта человека - E. coli (кишечную палочку).
Ученые научились не только выделять и клонировать нужные гены, но и всесторонне их изучать: определять последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК и аминокислот в белке, который кодирует ген, механизм регуляции его активности.
Все это позволило успешно осуществлять следующий этап создания генно-инженерных организмов: построение конструкций генов, которые предполагается перенести в геном реципиентного организма. Здесь не случайно речь идет о переносе не отдельных генов, а генетических конструкций, состоящих из нескольких генетических элементов: генов и регуляторных последовательностей. Как правило, конструкции собирают на основе определенных плазмид, к которым "пришивают" в нужной последовательности необходимые генетические элементы.
Как отмечалось выше, каждый ген имеет сложную систему регуляции своей активности, в отсутствие которой он просто не будет функционировать. Только для транскрипции гена (образования мРНК) обязательно наличие, помимо кодирующей области, также промотора, последовательности, обеспечивающей присоединение к мРНК поли А-хвоста, и последовательности, указывающей место окончания транскрипции. В придачу к этим обязательным элементам генетические конструкции могут содержать также регуляторные элементы, определяющие место и время активности переносимого гена (трансгена), другие гены (с соответствующими генетическими элементами), например так называемые селективные гены, с помощью которых выделяют трансформированные клетки реципиентного организма (клетки, в ДНК которых произошло встраивание трансгена) среди преобладающей массы трансформированных клеток.
|
|
Такие генетические конструкции "собирают" из фрагментов ДНК, которые могут принадлежать совершенно разным организмам, относящимся к весьма отдаленным систематическим группам, и даже с участием фрагментов ДНК, синтезированных искусственно.
Например, в плазмиду почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (A, tumefaciens) встраивают ген, выделенный из ДНК рыбы (ген холодоустойчивости от камбалы), промотор у этого гена - от вируса мозаики цветной капусты, последовательности присоединения по-лиА-хвоста и окончания транскрипции (терминальные последовательности) - от A. tumefaciens, селективный ген устойчивости к канамицину - из транспозона (подвижный генетический элемент) E. coli, промотор и терминальные последовательности у этого гена те же, что и у гена холодоустойчивости. И вся эта генетическая конструкция предназначена для переноса в растительный организм.
Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эукариотического только в прокариотическом организме (у бактерий, цианобактерий). В эукариотическом организме может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому при переносе генов от одного вида растений к другому можно использовать гены с их собственными промоторами. Но если в растение переносится бактериальный ген, то промотор у него должен быть заменен на растительный. В последнем случае часто используют промоторы от растительных вирусов. Вирусы по своей природе - существа исключительно активные. Ничто или практически ничто не может их остановить после того, как они нашли свою жертву (хозяина). Попав в клетку хозяина, вирусная ДНК интенсивно размножается и, клетки хозяина, активно воспроизводит себе подобных. Это происходит в силу того, что в процессе эволюции вирусы получили очень сильные промоторы, способные функционировать в любом генетическом окружении.
|
|
Проблема введения в растительную клетку чужеродной ДНК также в принципе решена. Используются два основных подхода.
Первый из них - агробактериальная трансформация. Это слегка модифицированный естественный процесс горизонтального (то есть между отдаленными в систематическом отношении группами организмов) переноса генов от бактерий в растения. В природе существует большая группа почвенных бактерий из рода Agrobacterium. Они могут вызывать у растений болезни типа рака - корончатый галл (опухоль) или "бородатые корни". Выяснено, что с помощью специального механизма бактерии передают в генетический материал растений небольшой фрагмент своей ДНК, содержащий гены, активность которых приводит к образованию у растений опухоли или многочисленных корней. В них синтезируются вещества - опины, являющиеся питательным субстратом исключительно для агробактерий. Ученые просто вырезали из переносимого фрагмента ДНК бактериальные гены, вызывающие болезнь, и заменили их нужными им генами с соответствующими регуляторными элементами. Агробактерии потом убивают с помощью антибиотиков, а из трансформированных клеток восстанавливают целое растение.
К сожалению, метод агробактериальной трансформации оказался недостаточно эффективным для большинства однодольных растений (хлебных злаков, кукурузы, лилейных и других). Поэтому для введения чужеродной ДНК в клетки таких растений чаще всего используют другой метод - бомбардировку клеток микроскопическими частицами из золота или вольфрама, на поверхность которых нанесена ДНК.
Процесс переноса и включения в генетический материал клеток растений чужеродной ДНК происходит в общем с небольшой частотой: в лучшем случае трансформированной оказывается одна клетка на тысячу. Поэтому необходимо каким-то образом отделить такие клетки от остальных, создать для их деления и дальнейшего развития наиболее благоприятные условия. В этих целях вместе с желаемым геном (например, устойчивости к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам) вводят и второй, так называемый селективный ген. Чаще всего для этого используют гены устойчивости к антибиотикам. Если после введения чужеродной ДНК поместить клетки на питательную среду с антибиотиком, то на ней способны будут расти только трансформированные клетки.
генетический модифицированный организм здоровье
Обычно в генетический материал клеток растений включается одна или две копии привнесенных генов. Многокопийность, как правило, сопровождается пониженной активностью привнесенных генов, а генотипы с несколькими копиями трансгенов не обладают требуемыми признаками и выбраковываются в ходе селекционного процесса. Даже в случае встраивания одной копии трансгена его активность может быть недостаточной. Поэтому получают много трансформантов, из которых отбирают лучшие по активности трансгенов и по комплексу хозяйственных признаков, без видимых мутаций и других нарушений.
Явление ослабления активности гена при увеличении числа его копий весьма широко используется в генетической инженерии для улучшения качественных характеристик сортов или пород. Так, с помощью привнесения дополнительных копий отдельных генов растений получены томаты с длительным сроком хранения, картофель с повышенным качеством крахмала (без амилозы), соя, рапс с улучшенным качеством масла, кофе без кофеина. В генетической инженерии животных таким образом снижают активность генов, ответственных за выработку белков-аллергенов (в креветках, в молоке коров, коз).
Итак, генно-инженерные организмы отличаются от исходных генотипов весьма незначительно: к 25 - 35 тысячам существующих генов добавляют один-два новых. При этом следят, чтобы активность собственных генов растения или животного не изменилась, чтобы не ухудшились его потребительские качества. [9, 10, 11, 12, 13]