Методы идентификации и разделения аминокислот

L-лейцинL-метионин

H3C                                    СH2-CH2-CH-COOH

   CH-CH2-CH-COOH   S-CH3 NH2

H3C          NH2

L- пролинL-изолейцин

CH2-CH2                     CH3-CH2-CH-CH-COOH

CH2---N---CH-COOH                      CH3 NH2

   H

Аланин – заменимая -(2-аминопропановая кислота) Алании присутствует в человеческих мышцах и является одной из нескольких аминокислот, превращающихся в глюкозу. Участвует в выработке лимфоцитов.Регулирует уровень сахара в крови.Помогает при заболеваниях предстательной железы у мужчин.Регулирует работу надпочечников..Основной компонент соединительных тканей.Главный посредник в глюкозо–аланиновом цикле, позволяющий мышцам и другим тканям получать энергию из аминокислот.Укрепляет иммунную систему.

Валин (2-амино-3-метилбутановая кислота) — незаменимая, алифатическая α-аминокислота, входит в состав практически всех известных белков.Валин служит одним из исходных веществ при биосинтезе пантотеновой кислоты-Витамина B5 и пенициллина. Один из главных компонентов в росте и синтезе тканей тела. Вместе с лейцином и изолейцином служит источником энергии в мышечных клетках, а также препятствует снижению уровня серотонина.

Лейцин - незаменимая ( 2-амино-4-метилпентановая кислота)— типичная алифатич. a-аминокислота,незаменимая. Аминокислота с разветвленными боковыми цепочками, используется как источник энергии.Встречается во всех организмах в составе молекул белков и пептидов. D.-Лейцин входит в состав грамицидина А и нек-рых др. прир. в-в. Наряду с изолейцином и валином необходима для роста как стимулятор синтеза белка в мышцах.Аминокислота с разветвленными боковыми цепочками, используется как источник энергии.Замедляет распад мышечного протеина.Способствует заживлению ран и сращиванию костей.Стабилизирует уровень сахара в крови.

Метионин- (2-амино-4-метилтиобутановая к-та-алифатическая серосодержащая α-аминокислота, входит в число незаменимых аминокислот. Содержится во многих белках и пептидах (метионин-энкефалин, метионин-окситоцин). Значительное количество метионина содержится в казеине.Метионин также служит в организме донором метильных,а также источником серы при биосинтезе цистеина. Играет важную роль в био-синтетич. метилировании. L-Метионин применяют для обогащения кормов и пищи, а также как лек.ср-во для лечения и предупреждения заболеваний и токсич. поражений печени, лечения атеросклероза; используют для синтеза пептидов.

Пролин- (пирролидин-α-карбоновая кислота) — гетероциклическая аминокислота, в которую атом азота входит в составе вторичного,). Существует в двух оптически изомерных формах — L и D, а также в виде рацемата. L-Пролин заменимая аминокислота. Входит в состав практически всех белков. Особенно богаты L-пролином коллаген, проламины (семена злаков) и эластин. В организме человека синтезируется из глутаминовой к-ты. Главный составной элемент коллагена.Для восстановления тканей после повреждений (особенно после ожогов) и хирургических операций.Эта аминокислота способствует формированию здоровых суставов, сухожилий, связок и сердечной мышц

Изолейцин- (2-амино-3-метилпентановая к-та- типичная алифатич. a-аминокислота (незаменимая аминокислота). Встречается во всех организмах в составе белков и пептидов. Рост и развитие поперечно-полосатых и продольных мышц; участие в выработке энергии; выработка гемоглобина; стабилизация и регулировка уровня сахара в крови; уменьшение усталости мышц при переутомлении; уменьшение вредного воздействия стресса; утилизация холестерина.

· Неполярные гидрофобные радикалы формируют гидрофобные связи в третичной структуре белка.

2. Структура и функция аминокислот с полярным(незаряженным) радикалом. Химическая модификация радикалов серина киназами и роль этих изменений в регуляции и функциональной активности белков. Роль радикалов серина и цистеина в обеспечении каталитической активности ферментов.

L-серинL-цистеин
CH2-CH-COOH               CH2-CH-COOH
OH NH2                        SH NH2

 

 

L- глутаминL-глицин

O=C-CH2-CH2-CH-COOH H-CH-COOH

NH2                                   NH2

 

 

L-треонинL-аспарагин

CH3-CH-CH-COOH    O=C-CH2-CH-COOH
   OH NH2               NH2 NH2

 

Серин-( 2-амино-3-гидроксипропионовая к-та), заменимая. Обладает св-вами аминокислот и спиртов. Остаток L-серина встречается во всех организмах в составе молекул белков, особенно много их в фиброине шелка..Фосфорилирование остатков серина в составе белков имеет важное значение в механизмах межклеточной передачи сигналов.Кроме того, серин участвует в биосинтезе ряда других заменимых аминокислот: глицина, цистеина, метионина, триптофана.

Цистеин- (2-амино-З-меркаптопропионовая к-та).Кодируемая заменимая α -аминокислота. Цистеин входит в состав белков и нек-рых пептидов (напр., глутатиона). входит в состав альфа-кератина, основного белка ногтей, кожи и волос.Цистеин входит в состав и других белков организма, в том числе некоторых пищеварительных ферментов.Цистеин помогает обезвреживать некоторые токсические вещества и защищает организм от повреждающего действия радиации.Цистеин является предшественником глютатиона.

Глутамин- типичная алифатич. α аминокислота, заменимая. L-Глутамин встречается во всех организмах в своб. виде (в свекле до 5,6%) и в составе белков. Для опухолевых клеток L-глутамин-незаменимый компонент. участие в азотистом обмене; синтез углево-дов, аминокислот; обезвреживание аммиака; энергетика клеток мозговой ткани; нейромедиаторная функция; участие в метаболизме калия; повышение устойчиво-сти организма к гипоксии; заживление и восстановление функций слизистой оболочки тонкого кишечника; удаление продуктов метаболизма жиров; гепатопротек-торное действие; усиление иммунитета; выделение гормона роста.

Глицин - (аминоуксусная к-та). -типичная алифатич. α аминокислота. В составе белков встречается чаще, чем др.аминокислоты. Служит предшественником в биосинтезе порфириновых соед. и пуриновых оснований. Глицин-кодируемая аминокислота, з аменимая;. -Незаменим для мышечной функции, разлагает гликоген, высвобождая энергию
-Образует гликоген путем растворения гликогена из печени.Помогает работе иммунной системы.Уменьшает содержание холестерина в крови. Способствует соединению неэссенциальной аминокислоты.

Треонин- (2-амино-3-гидроксимасляная к-та) -кодируемая, незаменимая аминокислота, входит в состав мн. Участвует в построении мышечного белка, поддерживает должный протеиновый баланс в организме. Треонин также улучшает состояние сердечно-сосудистой системы, печени, ЦНС и иммунную функцию. Из треонина в организме могут синтезироваться глицин и серин. Треонин позволяет укрепить мышцы (включая миокард) и связки. Кроме того, треонин делает кости менее хрупкими, повышает прочность эмали зубов.Треонин, наряду с метионином улучшает липотропную функцию печени, то есть распад жиров и жирных кислот.

Аспарагин- - типичная алифатич a- аминокислота, заменимая. L-Аспарагин-кодируемая аминокислота, встречается во всех организмах в своб. виде и в составе белков. Аспарагин необходим для поддержания баланса в процессах, происходящих в центральной нервной системе; препятствует как чрезмерному возбуждению, так и излишнему торможению. Он участвует в процессах синтеза аминокислот в печени.Больше всего аспарагина в мясных продуктах. Аспартовая кислота.Так как аспартовая кислота повышает жизненную силу, то ее применяют при усталости.Она играет также важную роль в процессах метаболизма. Аспартовую кислоту часто назначают при заболеваниях нервной системы.

· П ротеинкина́зы — подкласс ферментов киназ (фосфотрансфераз)Серин-треониновые протеинкиназы фосфоририруют гидроксильную группу в остатках серина или треонина.Серин/треониновые протеинкиназы фосфорилируют остатки серина или треонина в консенсусных последовательностях, которые образуют фосфоакцепторный сайт. Эта последовательность остатков аминокислот в молекуле субстрата, позволяет осуществлять контакт каталитической щели протеинкиназы с фосфорилируемой областью.

· Серин,цистеин участвуют в образовании активных центров ряда ферментов (эстераз, пептидгидролаз), обеспечивая их функцию. Протеолитические ферменты, активные центры которых содержат их, играют важную роль при выполнении каталитической функции, относят к отдельному классу пептидаз. Действие некоторых фосфорорганических соединений основано на необратимом присоединении молекулы яда к OH-  группам остатков серина, приводящему к полному ингибированию каталитической активности ферментов. Токсический эффект прежде всего связан с ингибированием ацетилхолинэстеразы.

3. Структура и функция аминокислот с полярным (заряженным отрицательно) радикалом. Роль радикалов. Роль этих аминокислот в обеспечении специфических функций белков. Амфотерные свойства аминокислот.

К этой группе относят аспарагиновую и глутаминовую аминокислоты, имеющие в радикале дополнительную карбоксильную группу, при рН около 7,0 диссоциирующую с образованием СОО^- и Н⁺. Следовательно, радикалы данных аминокислот - анионы. Ионизированные формы глутаминовой и аспарагиновой кислот называют соответственно глутаматом и аспартатом.

L- глутаминовая к-та

HOOC-CH2-CH2-CH-COOH

NH2

 

L-аспарагиновая к-та

HOOC-CH2-CH-COOH

NH2

Глутаминовая кислота (2-аминопентандиовая кислота) — алифатическая аминокислота. В живых организмах глутаминовая кислота в виде аниона глутамата присутствуют в составе белков, ряда низкомолекулярных веществ и в свободном виде. Глутаминовая кислота играет важную роль в азотистом обмене.

Глутаминовая кислота также является нейромедиаторной аминокислотой, одним из важных представителей класса «возбуждающихаминокислот» Связывание глутамата со специфическими рецепторами нейроновприводит к возбуждению последних.

 

Аспарагиновая кислота (аминоянтарная кислота, аспартат, аминобутандиовая кислота) — алифатическаяаминокислота, одна из 20 протеиногенных аминокислот организма. Встречается во всех организмах в свободном виде и в составе белков. Кроме того, выполняет роль нейромедиатора в центральной нервной системе.

 

Аминокислоты как амфотерные соединения образуют соли как с кислотами (по группе NH2), так и со щелочами (по группе СООН):

• Ионные связи могут возникать между отрицательно заряженными (анионными) карбоксильными группами радикалов аспарагиновой и глутаминовой кислот и положительно заряженными (катионными)-третичная структура белка

Структура и функция аминокислот с полярным (заряженным положительно) радикалом. Роль радикалов гистидина в гемоглобине и ферментах. Роль радикалов лизина в структурах коллагена и эластина.Гистоны.

 

Лизи́н (2,6-диаминогексановая кислота) — алифатическая аминокислота с выраженными свойствамиоснования; незаменимая аминокислота. входит в состав белков.необходима для роста, восстановления тканей, производства антител, гормонов, ферментов, альбуминов.,оказывает противовирусное действие, Лизин поддерживает уровень энергии и сохраняет здоровым сердце, благодаря карнитину, который в организме из него образуется. Лизин участвует в формировании коллагена..Лизин улучшает усвоение кальция из крови и транспорт его в костную ткань. Дефицит лизина неблагоприятно сказывается на синтезе белка.

Аргинин (2-амино-5-гуанидинпентановая кислота) — алифатическая основная α-аминокислота.Оптически активна, существует в виде L- и D- изомеров. L-Аргинин входит в состав пептидов и белков, особенно высоко содержание аргинина в основных белках — гистонах и протаминах (до 85 %).

Гистиди́н (L-α-амино-β-имидазолилпропионовая кислота) — гетероциклическая альфа-аминокислота. Гистидин входит в состав активных центров множества ферментов, является предшественником в биосинтезе гистамина. Одна из «существенных» аминокислот, способствует росту и восстановлению тканей. В большом количестве содержится в гемоглобине; используется при лечении ревматоидных артритов, аллергий, язв и анемии. Недостаток гистидина может вызвать ослабление слуха.

В миоглобине

гемоглобине над Fe2+ в области присоединения О2 расположен Гис Е7, нарушающий оптимальное расположение СО в центре связывания белков и ослабляющий его взаимодействие с гемом. Напротив, тот же Гис Е7 создаёт оптимальные условия для связывания О2. В результате сродство гема к СО в белках всего в 200 раз превышает его сродство к О2.
гистоны – белки основного характера. В их состав вход лизин, аргинин. Все эти белки сосредоточены в основном в ядрах клеток в составе дезоксирибонуклеопротениов и играют важную роль в регуляции экспрессии генов.Радикалы лизина и гидроксилизина необходимы для образования прочных поперечных сшивок между молекулами тропоколлагена

 

Методы идентификации и разделения аминокислот

Электрофорез основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе.

 Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной и подвижной.

Различают следующие разновидности хроматографии:

- адсорбционная - разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза служит опорой для стационарной жидкой фазы. Разновидностью является хроматография на бумаге;

- ионообменная - используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки;

- гель-хроматография, или метод молекулярных сит, основан на способности небольших молекул проникать в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки. Позволяет разделить белки с разной молекулярной массой.

Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и г азовая хроматография. Хроматография является одним из основных методов биохимических исследований. В клинических лабораториях ее применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

6. Напишите структуру пентапептида следующего состава: фен-про-асп-цис-вал. Определите заряд пептида при PH=7;1,5;12. Напишите план мероприятий по определению первичной структуры данного пептида.

рН=7 = -1

рН=1,5 = +1

рН=12 = -2

 шесть основных стадий:

Стадия 1, - определение аминокислотного состава.

гидролиз всех пептидных связей чистого полипептида. Образующаяся смесь аминокислот анализируется затем при помощи ионообменной хроматографии, что позволяет определить, какие аминокислоты и в каком соотношении присутствуют в гидролизате.

Стадия 2, - идентификация амино- и карбокси- концевых остатков.

идентификация аминокислотного остатка, находящегося на конце полипептидной цепи, несущего свободную альфа-аминогруппу,т.е. на аминоконце (NH2 - конце, или N-конце). Карбоксиконцевой (С- концевой) аминокислотный остаток тоже можно идентифицировать. Один из таких методов состоит в инкубировании полипептида с карбоксипептидазой, которая гидролизует только пептидную связь находящуюся на карбоксильном конце (С-конце) цепи. Определив, какая из аминокислот первой отщепилась от полипептида, при действии на него карбоксипептидазы, можно идентифицировать С-концевой остаток.

Стадия 3, - расщепление полипептидной цепи на фрагменты.

Наиболее распространенный метод для проведения такого расщепления - это частичный ферментативный гидролиз пептида под воздействием пищеварительного фермента трипсина. Этот фермент обладает высокой специфичностью действия: гидролизу подвергаются только те пептидные связи, которые образованы между карбоксильной группой лизина или аргинина и аминогруппой любой аминокислоты.

Стадия 4, - определение последовательности пептидных фрагментов

На этой стадии устанавливается аминокислотная последовательность в каждом из пептидных фрагментов, полученных на стадии 3.

Стадия 5,- расщепление исходной полипептидной цепи еще одним способом

Чтобы установить порядок расположения пептидных фрагментов, образовавшихся под действием трипсина, берут новую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо другим способом, при помощи которого расщепляются пептидные связи устойчивые к действию трипсина. Для этой цели предпочтительнее оказывается на химические методы.

Стадия 6, - установление порядка расположения пептидных фрагментов по перекрывающимся фрагментам.

Аминокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами, сравнивают, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых последовательности отдельных участков совпадали бы с последовательностями тех или иных участков пептидов первого набора. Пептиды из второго набора с перекрывающимися участками позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи.