Расщепление одноцепочечной ДНК универсальной рестриктазой

а – синтетический олигонуклеотид; б – одноцепочечная ДНК.

После образования шпильки и гибридизации с одноцепочечной ДНК-мишенью олигонуклеотид образует сайт связывания рестриктазы (участок I) и сайт расщепления ДНК-ДНК-гибрида (участок II). Стрелки указывают места эндонуклеазного расщепления ДНК и олигонуклеотида

Изошизомеры. В клетках разных видов бактерий могут содержаться рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Такие рестриктазы называют изошизомерами. Изошизомеры некоторых рестриктаз с успехом используются для обнаружения метилированных участков ДНК в геноме. Так, рестриктазы Hha I и Hpa II расщепляют неметилированные последовательности GCGC и CCGG соответственно и утрачивают способность к расщеплению, если хотя бы один из остатков цитозина в этих сайтах метилирован. В то же время фермент Msp I (изошизомер Hpa II) расщепляет последовательность CCGG независимо от того, метилированы или неметилированы остатки цитозина в таком сайте. N-Метилирование остатков аденозина в ДНК можно обнаружить с помощью изошизомеров Sau 3A (расщепляет как метилированные, так и неметилированные последовательности GATC), Dpn I (расщепляет только метилированные последовательности G^MeATC) и Mbo I (расщепляет только неметилированные последовательности).

Изменение специфичности действия рестриктаз в неоптимальных условиях. Рестриктазы являются высокоспецифическими ферментами. Однако для поддержания этой специфичности in vitro необходимо соблюдать в реакционной смеси оптимальные условия для действия ферментов. При нарушении таких условий у некоторых рестриктаз начинает проявляться вторичная (так называемая штриховая) активность. Так, рестриктаза EcoR I расщепляет последовательность GAATTC при pH 7,3, 100 мМ NaCl в присутствии 5 мМ MgСl₂, однако при изменении значений pH, понижении концентрации NaCl или замене ионов Mg²⁺ на Mn²⁺, а также в присутствии органических растворителей у фермента появляется тенденция к расщеплению более короткой последовательности AATT (так называемая активность EcoR I). К рестриктазам, обладающим подобными свойствами, относятся также BamH I, Bst I, Bsu I, Dde I, Hha I, Pst I, Sal I, Sst I, Xba I.

Действие рестриктаз на необычные субстраты. Помимо двухцепочечных ДНК многие рестриктазы способны использовать ДНК-РНК-гибриды в качестве субстрата. Это относится, в частности, к рестриктазам EcoR I, Hind II, Sal I, Msp I, Hha I, Alu I, Taq I и Hae III. Некоторые рестриктазы, например Hae III, Hha I и Sfa I, способны расщеплять одноцепочечную ДНК фага fX174, хотя и со значительно меньшей скоростью, чем соответствующую двухцепочечную RF-форму. Такая способность была продемонстрирована для некоторых других рестриктаз, а также ДНК-субстратов. Остается неясным, узнают ли эти рестриктазы истинные одноцепочечные сайты или же последовательности нуклеотидов, заключенные в элементы вторичной структуры.

С развитием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. ниже) часто возникает необходимость расщепления рестриктазами амплифицированных олигонуклеотидов недалеко от их концов, т.е. в условиях, когда сайт рестрикции фланкирован с одного из своих концов одним или несколькими нуклеотидами. В этом случае установлена четкая зависимость способности определенных рестриктаз расщеплять сайты рестрикции от количества фланкирующих сайт нуклеотидов. Данное свойство рестриктаз объясняют, в частности тем, что на самих концах двухцепочечной молекулы ДНК происходит локальное плавление двойной спирали ДНК с образованием коротких одноцепочечных участков, захватывающих сайт узнавания рестриктазами. Частично избежать локальное плавление можно понижением температуры реакционной смеси во время проведения рестрикции таких олигонуклеотидов.

Определение единицы активности рестриктазы. Расчет реакционной смеси для проведения рестрикции. Оптимальные условия работы рестриктаз. Звездная активность рестриктаз. Метил-чувствительные и метил-нечувствительные рестриктазы. Применение рестриктаз в ДНК-фингерпринт анализе (RLFP).

Молекулярные биологи рутинно используют рестриктазы для различных целей, включая картирование генома, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RLFP-анализ), секвенирование ДНК, клонирование генов. Хотя рестрикция и не является незаменимым методом для проведения различных экспериментов, ее проведение и использование обусловлено удобством, простотой и относительной дешевизной.

В настоящее время ученые выделяют от 3 до 8 типов (классов, подклассов) эндонуклеаз рестрикции, отличающихся по своему строению, функциям, условиям работы, а также сайтам действия. Однако в генетической инженерии широко используются рестриктазы II типа, которых насчитывается более 700 видов. Также к их достоинствам относятся: коммерческая доступность, удобство в применении, а, главное, способность гидролизовать молекулу ДНК в специфическом месте, которое называется палиндромом. Палиндромом называют короткие олигонуклеотидные последовательности (обычно от 4 до 8), которые одинаково читаются по обеим цепям ДНК в одном направлении. Согласно последним данным, «уникальными» ферментами (рестриктазами с уникальными палиндромными сайтами рестрикции) являются порядка 250 видов. Однако, на практике можно также использовать изошизомеры. Обычно, фермент имеет несколько изошизомеров, и, таким образом, дефицита многообразия рестриктаз, на сегодняшний день, практически не существует. Стоит отметить, что свойства рестриктаз, наличие изошизомеров и коммерческую доступность можно узнать на сайте фирмы-производителя (New England Biolabs, ThermoScientific – Fermentas, Promega, SibEnzyme и др.) ферментов или в базе данных REBASE (http://rebase.neb.com).

Все рестриктазы II типа для эффективного расщепления требуют присутствия ионов магния (обычно 10 мМ), в качестве кофактора. Поэтому особое внимание уделите содержанию ЭДТА в препарате ДНК. Большинство реакций следует проводить при температуре +37 ⁰С, однако, некоторые ферменты требуют меньших (Sma I, +25 ⁰С) или больших (Taq I, +65 ⁰С) значений. Для большинства ферментов значение оптимума рН лежит в интервале 7.0 – 8.0, а оптимум концентрации NaCl 50 – 100 мМ. Однако, некоторые ферменты очень чувствительны к наличию специфических добавок. Например, Sma I для своей работы требует наличия в буферном растворе KCl вместо NaCl. Восстановительные агенты, такие так дитиотреитол или бета-меркаптоэтанол обычно не влияют на активность фермента, однако, предохраняют его от окисления (растворенного кислорода). Бычий сывороточный альбумин (БСА) часто добавляется в реакционную смесь в качестве стабилизирующего агента. Он повышает концентрацию белков в растворе, приближая данное значение к внутриклеточной концентрации, покрывает гидрофобную поверхность пластиковых пробирок, предохраняет от денатурации молекулу фермента. БСА положительно влияет на активность многих рестриктаз при концентрации 100 мкг/мл. В некоторых случаях молекулы ферментов (например, EcoR I, Not I) стабилизируют путем введения в реакционную смесь неионных детергентов, таких как Тритон Х-100 или Твин-20. Еще более редкий случай – это использование S-аденозилметионина для активации эндонуклеазы Bsg I.