Формы разрывов двухцепочечных ДНК, образующихся под действием рестриктаз

Рестриктазы. Биологическая роль системы рестрикции-модификации бактерий. Виды рестриктаз. Рестриктазы II класса: особенности их строения и функций. Палиндромы. Классификация рестриктаз II класса: изошизомеры, неошизомеры, изокаудомеры. Образование фрагментов ДНК с «тупыми» и «липкими» концами.

Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции – рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции. В то же время метилазы используют для ограничения числа сайтов рестрикции и получения более крупных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз.

Классификация рестриктаз. По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз. Ферменты рестрикции типа I представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия ATP, S-аденозилметионина и ионов Mg²⁺, они не распознают специфические последовательности нуклеотидов и в силу этого не находят широкого применения в генной инженерии. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, требуют для проявления активности наличия в реакционной смеси ATP и ионов Mg²⁺ и чаще всего используются при молекулярном клонировании. Ферменты типа III также активны только в присутствии ATP и ионов Mg²⁺ и не проявляют абсолютной зависимости от S-аденозилметионина.

Формы разрывов двухцепочечных ДНК, образующихся под действием рестриктаз

а – 5’-выступающие (1), 3’-выступающие "липкие" (2) и "тупые" (3) концы ДНК, образующиеся под действием рестриктаз BamH I, Kpn I и Pvu II соответственно. Стрелками обозначены места разрывов цепей ДНК, пунктирной линией – ось симметрии сайтов рестрикции; б – лигирование с потерей сайта рестрикции

Названия рестриктаз складываются из первых букв видовых названий бактерий, в которых они обнаружены, например Eco – E. coli. В том случае, когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят дополнительную букву, например рестриктазы Hinc и Hind выделены из бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы с и d. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида, например Hae I, Hae II и Hae III из H. aegipticus.

Рестриктазы типа II – основной инструмент генной инженерии. Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, а по крайней мере три из них – октануклеотиды. Чем короче олигонуклеотидная последовательность сайта рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной последовательности нуклеотидов, в которой каждый из четырех нуклеотидов представлен с одинаковой частотой (50% А–Т-пар и 50% G–С-пар). Так, случайная тетрануклеотидная последовательность встречается в среднем через каждые 256 п.о. (4⁴), а гексануклеотидная – через каждые 4096 п.о. (4⁶). Однако в природных ДНК распределение нуклеотидов может заметно отличаться от случайного. Например, для эукариотических ДНК характерна низкая частота встречаемости динуклеотида CpG и соответственно сайтов рестрикции, содержащих эти динуклеотиды (рестриктазы Hha I, Hpa II, Taq I, Tha I, Ava I, Hae II, Hind II, SalI, Sma I, Xho I, Xma I). Существенное отклонение частоты встречаемости сайтов рестрикции от ожидаемого при случайном их распределении вдоль ДНК свойственно и хромосомам термофильных бактерий, которым, напротив, свойственно (хотя и не во всех случаях) обогащение по G–С-парам. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа II, характерно наличие в них симметрии второго порядка, т.е. узнаваемые ими последовательности представляют собой палиндромы, например у рестриктазы EcoR I – 5’-GAATTC-3’. Это означает, что нуклеотиды, расположенные в каждой из цепей на равном расстоянии от оси симметрии, комплементарны друг другу. Если точки расщепления противоположных цепей ДНК смещены друг относительно друга в сайте рестрикции, то образующиеся в результате рестрикции концы ДНК содержат выступающие одноцепочечные участки. Поскольку такие участки комплементарны сами себе и друг другу и могут между собой взаимодействовать, их часто называют " липкими" концами. В "липких" концах выступающим одноцепочечным участком может быть как 5’-, так и 3’-конец (рис. II.1, а). Формальным признаком образования 5’- или 3’-выступающих "липких" концов в сайтах рестрикции является расположение точки расщепления цепей ДНК в последовательности, используемой для обозначения сайта рестрикции, слева или справа от оси симметрии соответственно. У некоторых рестриктаз точки расщепления обеих цепей ДНК расположены непосредственно друг под другом в сайте рестрикции. В этом случае после расщепления ДНК "липких" концов не образуется, а получаются так называемые "тупые" концы, в которых нет выступающих одноцепочечных участков ДНК (см. рис. II.1, а). Имеется одно принципиальное функциональное различие между 5’- и 3’-выступающими "липкими" концами – последние невозможно пометить путем их достройки ДНК-полимеразой. Эту особенность следует иметь в виду при выборе рестриктаз для получения рестрикционных фрагментов ДНК, которые предполагается использовать в качестве зондов.

При конструировании рекомбинантных молекул полезно помнить, что, хотя рестриктазы BamH I, Bcl I, Bgl II и Xho II узнают разные сайты рестрикции, они образуют одни и те же "липкие" концы, GATC. То же характерно и для группы рестриктаз SalG I, Xho I и Ava I (NCGA). При лигировании (см. ниже) фрагментов ДНК, образованных рестриктазами одной из таких групп, происходит их объединение, но при этом исходные сайты рестрикции теряются, так как в результате образуется новая непрерывная последовательность нуклеотидов (см. рис. II.1, б). Сайты рестрикции для некоторых рестриктаз II типа не являются симметричными. Например, рестриктаза Hga I узнает асимметричную последовательность 5’-GACGC-3’, а одноцепочечные разрывы вносит в противоположные цепи ДНК, отступя вправо на 5 и 10 нуклеотидов соответственно:

5’-GACGC(N)₅¯

3’-CTGCG(N)₅(N)₅¯

Последовательности нуклеотидов образующихся "липких" концов являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Вследствие этого рестрикционные фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием данной рестриктазы, в смеси соединяются друг с другом лишь в строго определенной исходной последовательности, которая задается уникальными последовательностями нуклеотидов в "липких" концах рестрикционных фрагментов ДНК. Например, при расщеплении этой рестриктазой репликативной формы ДНК фага fX174 образуется 14 фрагментов, которые in vitro объединяются в правильную последовательность с образованием инфекционной fX174-ДНК.

Универсальные рестриктазы для одноцепочечных ДНК

На основе рестриктаз, узнающих асимметричные последовательности нуклеотидов, разработана система, позволяющая расщеплять молекулы одноцепочечной ДНК в любой заданной точке. С этой целью синтезируется олигонуклеотид, 5’-концевая часть которого содержит сайт, узнаваемый такой рестриктазой, а последовательность нуклеотидов 3’-концевой части комплементарна участку ДНК, в который необходимо внести эндонуклеазный разрыв. В результате гибридизации олигонуклеотида с одноцепочечной ДНК образуется структура, изображенная на рис. II.2. При этом фермент взаимодействует с сайтом узнавания (участок I), а разрывы вносятся по местам, обозначенным стрелками. Таким образом, положение места эндонуклеазного расщепления будет целиком зависеть от последовательности нуклеотидов участка II синтетического олигонуклеотида, комплементарного ДНК-субстрату.