Какими критериями руководствуются для выбора той или иной эндонуклеазы рестрикции?

Обычно, для различных экспериментов необходимо и удобно добавлять 1 мкл фермента на реакцию. Вследствие этого, большинство фирм-производителей стандартизуют концентрацию фермента в фасовке (обычно от 2 до 20 ед./мкл). Однако многие производители очень часто производят ферменты в высокой концентрации (до 100 ед./мкл), которые подходят для гидролиза больших количеств ДНК. Таким образом, когда вы используете ферментные препараты с низкой концентрацией, возрастает объем фермента. В данном случае не забывайте, что концентрация глицерина в рестрикционной смеси не должна превышать 5 %, для того чтобы избежать звездной активности. Если же вы используете ферментный препарат с высокой концентрацией, то его необходимо предварительно развести до оптимальной концентрации. Аликвоту можно хранить при ‑20⁰С длительное время.

Что такое звездная активность?

Когда условия расщепления ДНК каким-либо ферментом не оптимальны, гидролиз макромолекулы может происходить не по канонической палиндромной последовательности. Такое изменение активности называется звездной активностью. Обычно в таких случаях, последовательность ДНК, по которой происходит гидролиз, отличается от палиндромной на 1 – 3 нуклеотида.

Впервые звездная активность была обнаружена при гидролизе молекулы ДНК ферментом EcoR I в буферном растворе с низкой ионной силой и высоким рН (Polisky et al, 1975). В таких условиях наряду с палиндромом данного фермента G/AATTC, фермент был способен узнавать и расщеплять ДНК по следующему сайту N/AATTC. Позднее было отмечено, что звездная активность фермента также проявляется при замене ионов Mg²⁺ в буферном растворе на ионы Mn²⁺ (Hsu и Berg, 1978). Длительное инкубирование раствора ДНК с ферментом, высокая концентрация ДНК и фермента, глицерина и органических растворителей в рестрикционной смеси также являются причинами появления звездной активности. Рекомендуется поддерживать концентрацию глицерина в растворе не более 5%. Для этого обычно следует помнить, что объем добавляемого фермента не должен превышать 10% от объема реакционной смеси. Не стоит забывать, что неспецифическое расщепление молекулы ДНК очень часто наблюдается, вследствие недостаточной чистоты фермента и присутствием других рестриктаз. Для установления данной причины, необходимо провести гидролиз ДНК в оптимальных рабочих условиях фермента. Также можно варьировать различные концентрации ферментного препарата, ДНК, время инкубации, температуру, то есть, подобрать неоптимальные условия работы примесного энзима.

Каким образом метилирование влияет на активность рестриктаз?

Многие эндонуклеазы рестрикции чувствительны к метилированию. Это является частью природного механизма защиты бактериальной клетки от экзогенной ДНК. Однако множество штаммов E. coli, предназначенных для клонирования, экспрессируют гены EcoK I, dam или dcm метилаз. Например, dam метилаза узнает специфическую последовательность GATC и метилирует аденин в N6-положении. Эндонуклеаза Mbo I также узнает GATC, поэтому ДНК будет гидролизоваться лишь в случае, когда препарат получен из штамма E. coli, дефицитного по метилазам, например, GM2163. Dpn I – одна из немногих эндонуклеаз, способных к расщеплению метилированной ДНК. Она совместима с dam⁺ штаммами. Dcm метилаза узнает специфическую последовательность CC(A/T)GG и метилирует второй цитозин в С5-положении. Она блокирует работу таких ферментов, как Stu I и Aat I (Song, Rueter, Geiner, 1988).

Интересно, что метилирование ДНК может повлиять на активность фермента, даже и без совпадения сайтов. Так, довольно популярный фермент Xba I имеет сайт узнавания следующего вида: 5’ TCTAGA 3’, что не является специфическим сайтом для метилаз. Однако если впереди или после данного палиндома будут находиться последовательности GA или TC соответственно, то рестриктный сайт будет подвержен dam-метилированию (GA TC TA GA TC).

Проблемы с метилированием также возникают при работе с препаратами ДНК, выделенными их клеток млекопитающих и растений. Молекулы ДНК млекопитающих могут метилироваться по цитозину С5-положении у последовательностей CG, а в ДНК растений обычно метилируются CG или CNG последовательности. Большинство штаммов E. coli имеют так называемую mcr систему рестрикции, которая обеспечивает расщепление метилированной ДНК. Поэтому, если целью вашей работы является клонирование метилированной ДНК, то необходимо использовать mcr -дефицитные штаммы.