Каким образом субстрат влияет на активность рестриктаз?

Эндонуклеазы рестрикции часто используются сразу же после проведения реакции ПЦР. При этом не стоит забывать, что на активность фермента значительно может влиять буферный раствор, применяемый для амплификации, а также праймеры. К примеру, было показано, что присутствие праймеров в концентрации 1 μМ ингибирует работу рестриктаз Sma I и Nde I (Ambrol, 1993). Однако в большинстве случаев присутствие праймеров, даже в концентрации 100 μМ, не влияет на эффективность расщепления. Если вы не удовлетворены результатами гидролиза молекулы ДНК, полученного после реакции ПЦР, в таком случае необходимо провести обессоливающую хроматографию, диафильтрацию на мембранном фильтре. Это более быстрая процедура, чем экстракция ДНК смесью «фенол-хлороформ» и последующее осаждение спиртом.

В зависимости от положения сайтов рестрикции в молекуле ДНК (концевые или внутренние) эффективность расщепления может различаться. Многие рестриктазы могут гидролизовать ДНК по палиндромным последовательностям, расположенным на концах молекулы. Однако перед сайтом должно находиться хотя бы 1 – 4 нуклеотида, для возможности эффективного узнавания палиндрома. Причем, в зависимости от того, какие нуклеотиды расположены перед сайтом, эффективность гидролиза может тоже быть различной. Некоторые примеры приведены в следующей таблице.

На эффективность рестрикции кольцевой ДНК (плазмида, плазмидный вектор) сильно влияет конформация молекулы. Например, для расщепления суперскрученной формы плазмидной ДНК часто требуется большее количество фермента для достижения 100%-ного результата. Некоторые фирмы-изготовители ферментов специально определяют количество единиц рестриктазы, требующееся для полного гидролиза 1 мкг суперскрученной плазмиды.

Также на эффективность рестрикции влияет большое количество различных химических веществ. Остаточные количества SDS (после щелочного лизиса) ингибируют ферментативный гидролиз. Высокие концентрации солей, таких как NaCl, KCl, CsCl или ЭДТА также ингибируют рестрикцию. Соли способны концентрироваться в образце при осаждении ДНК 70%-ным этиловым спиртом. Отмывка осадка ДНК 70%-ным EtOH частично удаляет соли, однако, в таких случаях лучше проводить диализ. Контаминации белковой природы также являются негативным фактором для проведения рестрикции. Специфические эндонуклеазы имеют высокую аффинность к дцДНК и, следовательно, остаются при очистке. Для удаления белковых примесей широко используется экстракция ДНК смесью «фенол-хлороформ» и последующее осаждение спиртом. Однако следует помнить, что этанол также является ингибирующим агентом для рестрикции. Труднее обстоят дела с удалением коровых гистонов при получении препаратов ДНК из клеток млекопитающих и растений