Методы отбора для выделения мутантов бактерий

Генетическое изучение микроорганизмов, создавшее фундамент для современной селекции, стало возможным только, когда были разработаны способы выделения клоновых культур, или клонов. Клон - это генетически однородное потомство одной клетки. Важнейшим методом селекции микроорганизмов является отбор мутантов, т. е. организмов с измененными наследственными признаками, которые появляются в результате мутаций.

Метод обнаружения биохимических мутаций у микроорганизмов был предложен Г. Бидломи Е. Татумом, (клонов) с биохимическими мутациями, вызывающими утрату способности к синтезу каких-либо аминокислот, витаминов или оснований нуклеиновых кислот, производят путем проверки их способности расти на минимальной среде. Минимальной называется среда, в которой содержатся только соли и сахара. Многие микроорганизмы дикого типа могут расти на минимальной среде, так как они сами способны синтезировать нужные для своего роста метаболические вещества (аминокислоты, витамины, основания нуклеиновых кислот). Такие микроорганизмы называют прототрофными.

При наследственной утрате способности синтезировать какой-либо из метаболитов для роста микроорганизма необходима добавка этого метаболита в питательную среду. Среда, в которую добавлен возможно полный набор метаболитов (аминокислот, витаминов, оснований), называется полной. Микроорганизмы, нуждающиеся для своего роста в каких-либо компонентах полной среды, называют ауксотрофными. Поэтому иногда биохимическими мутациями у микроорганизмов называют наследственные изменения от прототрофного к ауксотрофному типу питания (прямые биохимические мутации).

Д ля выделения мутантных клонов, не способных синтезировать необходимые для своего роста вещества и в силу этого неспособных к росту на минимальной среде, анализируемую смесь клеток высевают на полную среду, и от каждой выросшей на ней колонии делают отсевы на две питательные среды: полную и минимальную. В этом случае из клеток с генотипом дикого типа, т. е. не нуждающихся для своего роста в веществах полной среды, разовьются колонии на минимальной среде. Из мутантных клеток, которые утратили свойство синтезировать какое-либо из необходимых для своего роста веществ, на минимальной среде колонии не разовьются. Таким образом, одновременная проверка клонов на двух разных средах позволяет выявить биохимические мутации.

Дж. Ледерберг предложил усовершенствованный метод выделения биохимических мутаций у микроорганизмов — метод отпечатков (replica plating). Для облегчения пересева колоний, применяют специальную печатку, имеющую размер чашки Петри. Плоскость печатки покрывают бархатом. Сначала к печатке с бархатом прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на полной среде. На ворсинках бархата остаются клетки отдельных колоний. Затем к этой печатке прикладывают две чашки — с минимальной и полной средой. После инкубации таких отпечатков сопоставляют колонии, выросшие на полной и на минимальной среде. Практически это делают таким образом: чашку с минимальной средой ставят на чашку с полной средой так, чтобы идентичные колонии совпали. Просматривая две совмещенные чашки в проходящем свете, на чашке с полной средой отмечают колонии, которые не выросли на минимальной среде. Это дает возможность обнаружить мутантные колонии.

Далее из мутантной колонии, выросшей на полной среде, делают отсевы на специальные среды, содержащие 1) только аминокислоты, 2) только витамины и 3) только основания нуклеиновых кислот. Колонии, не выросшие на одной из этих трех сред, относятся к мутантам, нуждающимся в одном из трех типов метаболитов. В дальнейшем проводят испытание на потребность в отдельном метаболите: определенной аминокислоте, витамине и т. д. Так обнаруживают прямые биохимические мутации у микроорганизмов.

Для выделения биохимических мутаций широко применяют также и метод частичного обогащения питательной среды. При этом к минимальной среде прибавляются в очень малых концентрациях компоненты полной среды. Высеянные на такую среду клетки дикого типа, не нуждающиеся в веществах полной среды, дают начало колониям нормального размера. Биохимические мутанты, не растущие на минимальной среде, использовав необходимые им вещества в частично обогащенной питательной среде, прекращают рост и в результате образуют мелкие колонии. По этим мелким колониям можно отобрать мутантные.

Метод концентрирования биохимических мутантов. Установлено, что пенициллин поражает только делящиеся клетки. Так как в минимальной среде нормально размножаются клетки только дикого типа, то они в основном и поражаются. Не размножающиеся на минимальной среде биохимические мутанты не поражаются. Затем клетки отмывают от пенициллина и высевают на полную среду в чашки Петри. Так как большая часть клеток дикого типа была убита пенициллином, то среди вырастающих колоний на полной среде относительное количество колоний биохимических мутантов оказывается увеличенным. Из выросших колоний делают отпечатки на минимальную среду и выделяют мутанты.

Для учета обратных биохимических мутаций, т. е. от ауксотрофного к прототрофному типу, применяют метод селективных сред. Селективной называется полная среда без какого-либо определенного метаболита, на которой могут расти лишь клетки определенного генотипа. На такой среде из большой популяции клеток отбираются единичные мутантные клетки. Например, высевая культуру кишечной палочки Е. coli, нуждающуюся в витамине — биотине, на среду, лишенную его, можно отбирать мутации, восстанавливающие способность синтезировать биотин, так как к росту способны только клетки, претерпевшие обратные мутации, т. е. возвратившие способность синтезировать биотин. Среда, лишенная биотина и, следовательно, не пригодная для роста прямой мутантной формы, может служить селективной для обнаружения обратных мутаций.