Методы культивирования фагов, их индикация

Бактериофаги широко распространены в окружающей среде - водоемах, почве. Фаги кишечных бактерий (кишечной палочки, шигелл, сальмонелл) могут быть выделены из сточных вод и испражнений. Фаги стафилококков обнаруживают в слизи из носоглотки, на коже и в раневом отделяемом, фаги клостридий, вызывающих анаэробную раневую инфекцию, - в раневом отделяемом, почве. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему бактерий.

Поскольку бактериофаги размножаются в клетках специфического хозяина, ему необходимо обеспечить оптимальные условия роста и инфицировать его в период активного развития культуры, обычно в логарифмической фазе. Бактериофагов можно культивировать: частиц вирусов и клеток хозяина в питательной среде с полужидким агаром (0,3-0,9%); смысл этой процедуры состоит в иммобилизации будущих зон лизиса.

Количественный учет бактериофагов. Через определенное время после заражения (~3 ч для жидкой культуры и ~20 ч для культуры на агаризованной среде) вирусная инфекция проявляется визуально: в первом случае культура становится прозрачной, во втором случае на поверхности агара образуются бляшки.

Самый распространенный способ количественного учета бактериофагов — это титрование, основанное на подсчете числа бляшек, которые образуются в «двухслойной» культуре. Для достоверного подсчета перед высевом готовят серийные 10-кратные разведения вирусной суспензии или фаголизата. Принято считать, что отдельная бляшка соответствует инфекционной частице, или бляшкообразующей единице.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бактериальной культуры сопровождается лизисом бактерий и просветлением среды. На газоне чувствительных бактерий, выращенных на плотной питательной среде в чашке Петри, фаги образуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага, или стерильных пятен – бляшек.

Они имеют морфологию, характерную для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частицы при ее внедрении и последующей репродукции в бактериальных клетках. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются негативные колонии фага. Для получения "чистой" линии фага (свободной от примеси других фагов) проводят последовательные пассажи морфологически однотипных негативных колоний на газоне одного и того же бактериального штамма.

Билет22