Задача поиска (новых) ферментов для синтетических метаболических сетей

Из приведенных выше примеров становится очевидным, что для построения полностью новых путей и/или сложных каскадов реакций требуются ресурсы, которые предоставляют синтетическим биологам информацию для поиска отдельных ферментов для данной синтетической метаболической сети. Более 116 миллионов белков были депонированы в базы данных последовательности белков, такие как UniProtKB [29]. Более 40 000 ферментов были биохимически охарактеризованы, и соответствующие данные имеются в специализированных базах данных ферментов, таких как BRENDA [30]. Это богатство биологической информации обеспечивает хорошую отправную точку для поиска ферментативных вариантов, обладающих желаемой каталитической активностью.

В то время как существующие базы данных могут предоставить хороший ресурс для поиска деталей для реконструкции путей уровня 3, эта задача становится более сложной в отношении проектов уровня 4 и уровня 5, которые требуют новых реакций на природу. Как можно идентифицировать или установить эти новые ферментативные реакции? Одним из вариантов является de novo-проектирование ферментов с помощью вычислительных методов, которые были разработаны в течение последних нескольких лет. В сочетании с экспериментальной эволюцией и разработанными методами скрининга эти усилия позволили с нуля установить совершенно новые ферментативные реакции [31-34].

Однако, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в создании ферментов с помощью вычислительных методов [35], это комплементарный (и в равной степени обоснованный) подход к открытию и/или проектированию новых реакций из природного разнообразия ферментативных скаффолдов [36-39]. Одним из примеров является формальдегидная ЛиАЗа (или” формолаза") - ключевой фермент формолазного пути – который был изготовлен из бензальдегидной ЛиАЗы, которая первоначально проявляла некоторую побочную реактивность с формальдегидом [17,24]. Другими примерами являются пропионил-СОА оксидаза и метилсукцинил-СОА оксидаза в циклах CETCH, которые были спроектированы из неразборчивой короткоцепочечной ацил-СОА оксидазы и FAD-зависимой метилсукцинил-СОА дегидрогеназы, соответственно [13,40,41].

Эти усилия по использованию промискуитета ферментов для создания новых катализаторов могли бы принести пользу от новых вычислительных методов, которые преуспели в создании активных участков замечательной промискуитной активности в каркасе существующих ферментов [42]. Такие вычислительно созданные "каталитически разнообразные активные участки" могут быть в дальнейшем развиты в направлении новой активности посредством направленной эволюции. Без каких-либо вопросов, скрининг последовательности белков и ферментных баз данных для подходящих кандидатов является ключевым фактором для развития метаболического ретросинтеза. Однако все еще существуют некоторые практические проблемы в извлечении необходимой информации из различных баз данных. Одной из частных проблем баз данных последовательностей, таких как UniProtKB, является большое количество неверно выделенных белков, что вызвано автоматизированными алгоритмами аннотирования, которые часто основаны на “простых” сходствах последовательностей [43,44]. В выбранных семействах ферментов (супер) ошибка аннотирования может достигать 90% [45], что маскирует или даже затрудняет идентификацию новых функций в пределах данного семейства ферментов (супер). Примером могут служить редуцирующие эноил-Коа карбоксилазы, которые большую часть времени были аннотированы как обычные эноил-КоА редуктазы, с которыми они филогенетически связаны [46,47]. Другим примером являются Рубископодобные белки [48], которые являются енолазами [49], изомеразами [50] и транскарбоксилазами [51], соответственно, которые не способны фиксировать _СО2, но все еще очень часто неправильно понимаются как их гомологи фиксации СО2 рубиско, с которыми они имеют общую эволюционную историю [52].

Решение для преодоления проблемы неправильного перевода может быть получено с помощью новых вычислительных средств, которые были разработаны недавно для анализа разнообразия ферментных (супер) семейств в отношении новых функций [53-55]. В то время как эти инструменты были успешно использованы для выявления и обнаружения новых метаболических путей (Balskus и др.), они также могут быть использованы для выявления интересных кандидатов ферментов, подлежащих скринингу для новых каталитических реакций в метаболическом ретросинтезе. Дальнейшие усовершенствования в моделировании гомологии и виртуальной стыковке, как ожидается, повысят точность и пропускную способность, что позволит в будущем картографировать и прогнозировать субстрат и реакции, катализируемые суперсемейством ферментов и его отдельными членами.