Метаболический ретросинтез: следующий уровень метаболической инженерии

В последнее время была разработана концепция “синтетического метаболизма”, направленная на преодоление ограничений, обусловленных естественным метаболизмом, путем реализации совершенно новых метаболических сетей [11,12]. Новые сети разработаны на основе первых принципов, основанных на простых физико-химических соображениях, таких как Кинетика и термодинамика. Для проектирования определены исходное соединение и молекула-мишень и определен короткий, термодинамически осуществимый и энергетически эффективный маршрут, соединяющий эти две молекулы. В то время как инженерные усилия уровня 3 направлены на создание новых путей решения путем смешивания и сопоставления известных ферментов из различных метаболических путей, проектные усилия в их наиболее продвинутой форме (т. е., уровень 4 и уровень 5) не строятся на существующих ферментах, а только рассматривают вероятные химические превращения и возможные метаболические промежуточные продукты [13-16]. На последующем этапе реализации определяются и/или проектируются соответствующие ферменты для реализации теоретической сети, и реконструируется первая версия синтетической сети. Сеть дополнительно оптимизируется или эволюционирует в следующих раундах в отношении скорости производства и доходности.

Например, недавно было разработано несколько новых путей уровня 3 и уровня 4 для превращения _СО2 в органические кислоты [13,14]. Предполагается, что эти пути будут более эффективными, чем естественный эволюционный цикл фотосинтеза Кальвина, поскольку они требуют меньше энергии (АТФ, окислительно-восстановительная сила и/или фотоны) и могут предположительно работать с более высокими каталитическими скоростями по сравнению с естественной фиксацией углерода. Соответственно, синтетический СО2- циклы фиксации должны быть способны преобразовывать большее количество углекислого газа с меньшей энергией за заданное время и, следовательно, преуспевать в естественном фотосинтезе по объемной емкости и энергетической эффективности. Один из этих проектов, так называемый цикл CETCH (рис. 2а), синтетический путь уровня 4 для преобразования _СО2 в органические кислоты, был экспериментально реализован in vitro путем объединения 17 ферментов (включая три инженерных) из общего числа девяти различных организмов из всех трех областей жизни [13]. По сравнению с первой версией цикла, система была дополнительно улучшена до версии 5.4 почти в 20 раз, что указывает на то, что последующая оптимизация системы может быть столь же важной, как и первоначальная реконструкция [13].

Рисунок 2: Два пути уровня 4, которые были недавно реализованы в пробирке. а) цикл Кетча для фиксации CO2 [13] и Б) путь формолазы для ассимиляции формиата [17]. Важные ферменты, которые были разработаны для установления этих циклов и упомянуты в тексте, выделены фиолетовым цветом.

Аналогичным образом были разработаны многочисленные маршруты уровня 3 и уровня 4 для преобразования одноуглеродистого формиата соединения в клеточные строительные блоки, которые теоретически должны были превзойти пути ассимиляции природного формиата [18,19]. Некоторые из путей уровня 3 были недавно реконструированы in vivo [20-23], а один из растворов уровня 4-Путь формолазы (рис. 2b) - был продемонстрирован уже in vitro [17]. Этот путь основан на трех новых для природы реакциях, наиболее заметной из которых является именная реакция формолазы, которая позволяет последующей конденсации трех молекул формальдегида в трехуглеродное соединение дигидроксиацетонфосфат [24]. Кроме того, было разработано несколько альтернативных способов фотореспирации, ассимиляции метанола, а также гликолитических путей уровней 3 и 4, которые предположительно являются более углеродными и энергоэффективными по сравнению с их естественно эволюционировавшими эквивалентами [23,25-28].

Тем не менее, в то время как все большее число теоретических проектов предлагается, успешная экспериментальная реализация многих из этих проектов в лаборатории все еще не достигает своей цели. Это особенно верно для путей уровней проектирования 4 и 5, которые характеризуются новыми реакциями, для которых соответствующие ферменты неизвестны (т. е. не были описаны до настоящего времени). Реализация этих путей строго ограничена нашей ограниченной способностью открывать и / или проектировать новые для природы ферменты. Заметными исключениями являются формолазный путь и цикл CETCH, которые требовали от каждого из них установления трех новых ферментативных реакций для их успешной реализации. Однако другие конструкции путей 4-го уровня требуют установления более чем десяти до сих пор неизвестных ферментативных реакций, подчеркивая сложность реализации истинно синтетических метаболических сетей [13].