Промискуитет фермента: ключ и вызов для синтетического метаболизма

Еще одна проблема заключается в том, что даже в базах данных, которые перечисляют экспериментально подтвержденную активность ферментов, очень часто недостаточно хорошо документируется важный аспект: субстратный (и реакционный) промискуитет. Тем не менее, эта информация имеет важное значение для выявления подходящих шаблонов-кандидатов для разработки или развития новой активности в пределах костяка данного фермента. Например, хотя база данных бренда, вероятно, является одним из лучших ресурсов для изучения подробных каталитических свойств ферментов, она предоставляет только в отдельных случаях подробную информацию об активности данного фермента с различными аналогами субстрата. Помимо предоставления необходимой информации для выявления интересных кандидатов ферментов для построения путей уровня 4 и уровня 5, более систематические данные о промискуитете ферментов также позволили бы получить более целостное представление о каталитическом (и эволюционном) потенциале полного суперсемейства ферментов [56].

Отметим, что информация о субстратной и / или реакционной промискуитетности важна не только для установления новых ферментативных реакций, но и для получения весьма практической информации при фактическом построении и оптимизации синтетических метаболических сетей. Одна из проблем в реализации метаболических сетей с нуля с помощью ферментов, которые не развивались в том же физиологическом контексте является то, что отдельные ферменты в такой микс-и-матч сетях склонны занимать сторону реакционной способности с субстратами или продуктами других ферментов в синтетические сети, скорее всего из-за отсутствия общей эволюционной истории, который отбирает для строгой субстратной специфичности [57]. Эти нежелательные побочные реакции способны конкурировать с желаемыми реакциями синтетической сети и могут привести к накоплению тупиковых продуктов, тем самым уменьшая или даже ингибируя поток через всю синтетическую сеть [58]. Следовательно, важно узнать о таких нежелательных побочных реакциях до реконструкции сети, чтобы избежать бесплодных взаимодействий и неоптимального функционирования системы.

Опять же, цикл CETCH дает хороший пример, почему информация о промискуитете ферментов так важна для метаболических ретроспективных усилий. В первых вариантах синтетического пути, промискуитетная метилмалил-Коа ЛиАЗа вызвала накопление малил-Коа из нежелательной побочной реакции фермента с ацетил-КоА, которая остановила цикл. Чтобы преодолеть проблему нежелательного накопления malyl-CoA, тиоэстераза malyl-CoA [59] пришлось добавить к синтетической сети. Этот энзим эффектно рециркулирует метаболит тупика назад в 2 промежуточных звена сети, малат и свободный CoA, таким образом служа как энзим “proof-reading” на периферии цикла CETCH для того чтобы держать систему побежать. Еще одна проблема была поставлена из-за неразборчивой активности пропионил-СОА карбоксилазы с ацетил-СОА. Эта проблема была решена путем замены проблемной реакции другим ферментативным путем. Наконец, первоначально смешанная ацил-СОА оксидаза была дополнительно разработана для повышения каталитической эффективности для желаемого субстрата пропионил-СОА по сравнению с нежелательным субстратом 4-гидроксибутирил-СОА в 50 раз [13]. Зная эти проблемные побочные реакции заранее, вероятно, можно было бы позволить более рациональный дизайн и / или избежать некоторых проблем заранее [58].

Тем не менее, необходимо отметить, что даже если сложные синтетические метаболические сети могут быть реализованы in vitro, это не означает, что эти метаболические сети могут быть легко пересажены в живые клетки. Ожидается, что введение новых реакций и метаболитов в клетку-хозяина создаст взаимодействие с нативной метаболической и регуляторной сетью хозяина. Опять же, промискуитет представляет собой серьезную проблему. Даже если метаболиты и реакции могут быть совершенно неродными для клетки, эти промежуточные звенья все еще могут быть истощены из-за нежелательных побочных реакций или создавать нежелательные метаболические и регуляторные эффекты, которые отрицательно влияют или даже запрещают работу синтетической метаболической сети внутри хозяина. Эта проблема усугубляется тем, что для такого хорошо изученного организма, как Е. коли, функция большого количества ферментов остается до сих пор неизвестной и, вероятно, существуют сотни, если не тысячи неизвестных реакций и метаболитов, часто описываемых как каталитическая или метаболическая “темная материя” [53,60]. Таким образом, более детальное понимание неразборчивости нативных ферментов и взаимодействия малых молекул с нативной регуляторной сетью клеток является важной предпосылкой для реализации синтетического метаболизма в будущем [61]. В этом контексте было бы также очень интересно узнать, какие клеточные хосты лучше всего подходят для трансплантации данной искусственной сети, или если существующие подходы к созданию синтетических клеток снизу вверх могут представлять собой ценную альтернативную стратегию [6].