2020-07-12
446
Известно, что частота отклонений от нормы у яйцеклеток, выделившихся во время суперовуляции, более высокая, чем у животных без гормональных обработок. Поэтому после суперовуляции оплодотворяются не все яйцеклетки, а из оплодотворившихся яйцеклеток не всегда развиваются полноценные зародыши, пригодные к пересадке. Для достижения высоких результатов отбирают зародышей, способных к дальнейшему развитию реципиента.
Извлеченных эмбрионов перед пересадкой сортируют по качеству с целью отбора наиболее жизнеспособных, чтобы приживляемость довести до 40-60%, а в лучшем случае до 80-90%.
Однако в настоящее время наибольшее распространение в практике получил лишь метод морфологической оценки.
Существует несколько методов оценки жизнеспособности эмбрионов:
1) Морфологическая;
2) Метод окраски;
3) Культивирование;
4) Временная пересадка в организм промежуточного хозяина;
5) Определение метаболической активности.
Однако в настоящее время наибольшее распространение в практике получил лишь метод морфологической оценки.
Вто же время, метод морфологической оценки еще далек от совершенства, иначе трудно объяснить причину гибели примерно половины трансплантированных качественных эмбрионов или напротив при пересадке непригодных и получении при этом около 20% стельности.
Вто же время при работе с эмбрионами необходимо создать оптимальные условия для их существования до пересадки в матку реципиента. Это температурный режим, качество посуды и лабораторного оборудования. Нужно помнить что посуда, изготовленная из пластмасс, обладает биологической токсичностью, особенно при стерилизации облучением.
Для поиска эмбрионов и яйцеклеток в вымывной жидкости (около 100 мл) используют стереоскопические микроскопы с 254
увеличением 10-30 раз (бинокулярные микроскопы МБС-9 или МБС-10). Обнаруженные зародыши переносят на часовые стекла с готовой стерильной средой.
Для непродолжительного хранения эмбрионов используют ФБС(фосфатно-буферный солевой раствор) Дюльбекко с добавлением фетальной сыворотки кр. р. с. или бычьего сывороточного альбумина.
Любая сыворотка крови, включаемая в состав среды для работы с эмбрионами, должна быть предварительно подвергнута инактивации нагреванием (до 56°Св течение 30 минут), чтобы денатурировать посторонние белки.
Температурный режим для хранения эмбрионов (от 0 до 38°С) довольно широк. Однако на практике извлеченную из матки среду чаще оставляют при комнатной температуре и хранят эмбрионы до пересадки реципиентам максимум сутки.
Эмбрионы, извлеченные из матки в 6-8-дневном возрасте, содержат от 30 до 200 клеток и по структуре зародыш относят к морулам или бластоцистам.
Главный критерий жизнеспособности эмбрионов -соответствие их стадии развития, возрасту в днях. Отсчет возраста ведут со дня появления у донора признаков охоты (день=0).
Кроме того, учитывают целостность и форму прозрачной оболочки, равномерность дробления бластомеров и состояние их цитоплазмы, величину и прозрачность перивителлинового пространства. Зародыши с признаками дегенерации, уродств и недоразвития для пересадок непригодны.
Начинающему рекомендуют возраст эмбриона вначале определять методом сравнения структуры зародышей с бластографией, т. е. фотографическими отпечатками натуральных зародышей, классифицированных по возрасту и качеству. Обычно после 500-1000 самостоятельных оценок у начинающего специалиста появляется навык в распознании жизнеспособности эмбрионов на разных стадиях развития.
Задержка в стадии развития эмбриона относительно ожидаемой на 2е и более суток свидетельствует о его непригодности.
Исследователи чаще пользуются 4-бальной системой оценки эмбрионов:
1. Отличные -эмбрионы идеально соответствуют стадии развития округлой формы, однородные по цвету.
2. Хорошие -эмбрионы соответствуют стадии развития, но отличаются от I категории незначительными отклонениями (сжатый зародыш, появление мертвых клеток). 255
зона пеллюцида
(прозрачная оболочка)
бластомеры
(30-60 кл.)
МОРУЛА
(6 дней)
25
перивителлиновое
пространство
бластомеры (40-60 кл.)
зона пеллюцида
РАННЯЯБЛАСТОЦИСТА
(7 дней)
25
перивителлиновое
пространство
начало формирования
бластоцели
трофобласт
зона пеллюцида
трофобласт
БЛАСТОЦИСТА
(8-9 дней)
бластоцель
внутренняя клеточная
масса
Рис. 106. Схематическое изображение эмбрионов в возрасте 6-9 дней.256
3. Посредственные или сомнительные -эмбрионы дегенерированные и отстают в развитии, имеют значительные отклонения в структуре зародышевых клеток, неоднородный цвет и просветление зародышевой массы, выход множества мертвых клеток.
4. Плохие -эмбрионы сильно отстают в развитии или имеют более 50% дегенерированных клеток.
Рис. 107. Бластоциста без зоны пеллюцида (9-й день).
а б в г
Рис. 108. Морула ранняя:
а -отличная (Мо ++); б -хорошая (Мо I+);
в -удовлетворительная (Мо I+-); г -дегенерированная (Мо I--).
а б в г
Рис. 109. Морула поздняя:
а -отличная (Мо II++); б -хорошая (Мо II+);
в -удовлетворительная (Мо II+-); г -дегенерированная (Мо II--). 257
Культивирование, криоконсервирование
