2020-10-11
916
МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ
ФИЗИЧЕСКИЕ ХИМИЧЕСКИЕ
Фильтрованием Растворами
Излучениями Газообразными
Высокой температурой веществами
МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ ВЫСОКОЙ ТЕМПЕРАТУРОЙ.
1. Прокаливание в пламени горелки - самый быстрый и надежный метод. Этим методом стерилизуют бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметы из стекла и другое мелкое оборудование.
Для стерилизации обрабатываемый материал (предмет) несколько раз проводят через пламя горелки. При прокаливании происходит сгорание микроорганзмов и их спор. Следует отметить, что прокаливание режущих предметов приводит к их порче, а стеклянные предметы часто трескаются и плавятся, что ограничивает возможность этого метода.
2. Стерилизация сухим жаром (или горячим воздухом) – проводится в сушильных шкафах (печах Пастера). Этим методом стерилизуют пробирки, пипетки, колбы, чашки Петри, другую стеклянную посуду и металлический инструмент. Перед стерилизацией посуду хорошо моют, высушивают, закрывают ватными пробками пробирки и колбы, пипетки и чашки заворачивают в бумагу. Стерилизация проводится при 160 - 180° в течение 1 - 1,5 часов с момента достижения этой температуры, при этом погибают и вегетативные клетки и споры бактерий.
3. Кипячение - простейший способ стерилизации игл, шприцев и хирургических инструментов. Кипячение проводят в стерилизаторах в течение 10 - 15 мин. с добавлением 1-2% раствора соды, что устраняет жесткость воды и предохраняет металлические предметы от ржавчины после кипячения. Этот метод не обеспечивает полной стерилизации, так как споры некоторых бацилл и клостридий выдерживают кипячение в течение нескольких часов.
4. Стерилизация паром под давлением. Самый эффективный в бактериологической практике способ стерилизации. Даже однократная стерилизация паром под давлением уничтожает не только вегетативные, но и споровые формы бактерий. Производится стерилизация в автоклавах. Автоклав впервые введен в практику нашим соотечественником Гейденрейхом в 1884 г. В автоклавах стерилизуют питательные среды, лабораторную посуду, отработанные культуры.
Режим работы автоклава:
| Давление | ТоС |
| 0,5 атм. | 110° - 122°С |
| 1 атм. | 121° - 122°С |
| 1,5 атм. | 127°С |
| 2 атм. | 152°С |
1. МПА, МПБ посуда: 1 атм. - 50 мин.;
2. среды, содержащие сахара: 0,5 атм. 15 - 20мин .; при более высокой температуре происходит карамелизация сахара.
5. Тиндализация. Проводится с целью уничтожения микроорганизмов в веществах, легко разрушающихся и денатурирующихся при температуре больше 60°. Прогревание проводится в водяных банях или других приборах при температуре 56 - 60°. в течение часа с 5 - 6 кратным повторением через каждые 24 часа. В интервалах между прогреваниями материал выдерживается при комнатной температуре. За это время споровые формы микробов прорастают и превращаются в вегетативные, которые погибают при повторных прогревах.
6. Пастеризация. Однократное прогревание материала в течение 1 часа при температуре 65 - 70° или 5-10 мин. при 75 - 80°. Этот метод направлен на уничтожение вегетативных форм, преимущественно патогенных м.о. Споровые же формы и многие сапрофиты сохраняются. Применяется этот метод для стерилизации молока, пива, вина и др. продуктов. При пастеризации полностью сохраняются витамины и вкусовые качества продукта. Пастеризованные продукты долгому хранению не подлежат.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ФИЛЬТРОВАНИЕМ.
Применяется для освобождения от м.о. различных жидкостей (питательных сред и др.), которые нельзя подвергать воздействию высокой температуры. Этим методом механически отделяют микроорганизмы от субстрата.
Фильтр Зейтца - круглые асбестовые пластины, вставленные в механические держатели.
Свечи Шамберлана - небольшие полые цилиндры с определенным диаметром пор, обозначаемых номерами. Фильтрование ведется под давлением или в вакууме. Для генерации свечей их кипятят в водопроводной воде, а затем прокаливают в муфельной печи.
Мембранные фильтры - из нитроцеллюлозы (нитроклетчатки), они обозначены номерами в зависимости от диаметра пор (от 350ммк. до 1200 ммк.). Стерилизуют их кипячением в дистиллированной воде в течение 20 мин.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ИЗЛУЧЕНИЯМИ.
Стерилизация УФ-лучами - применяется главным образом для стерилизации воздуха помещений. Ультрафиолетовое излучение обладает высокой повреждающей активностью, поэтому КАТЕГОРИЧЕСКИ ЗАПРЕЩАЕТСЯ НАХОДИТСЯ В ПОМЕЩЕНИИ ПРИ РАБОТАЮЩЕМ УФ ИЗЛУЧАТЕЛЕ.
Для стерилизации некоторых объектов используют и другие виды излучений: жесткое ионизирующее излучение, поток электронов и др.
ХИМИЧЕСКАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ.
Химическая стерилизация основана на губительном действии химических веществ на микробы. Химические вещества применяются для уничтожения микроорганизмов в различных ситуациях: в объектах внешней среды, на рабочем месте, в помещениях. Ими стерилизуют рабочую одежду, моют руки и т.д. В случаях, когда уничтожаются патогенные микроорганизмы, говорят о дезинфекции. После дезинфекции в том или ином материале или среде могут сохраняться жизнеспособные сапрофиты Понятие «стерилизация» шире понятия «дезинфекция». Для дезинфекции применяют: 3 - 5 % раствор фенола, 0,5 - 2 % раствор формалина, 10% р-р хлорной извести, 0,5 - 5% р-р хлорамина, р-р йода, сулемы, (дезинфицируют столы в операционных) и др. Для консервирования вакцин и лечебных сывороток пользуются фенолом (0, 25—5%), формалином (0, 05%), хлороформом (0, 5%). Глицерин, борную кислоту и толуол употребляют для консервирования агглютинирующих сывороток. Предметы, зараженные патогенными микробами ми, во время лабораторной работы дезинфицируются 3% раствором перекиси водорода с моющим средством, 1% раствором сулемы, 3% раствором фенола, 2,5% раствором крезола, 1—3% раствором хлорамина, 1 % осветленным раствором хлорной извести и 700 спиртом, а выделения больных (кал, мокрота и др.) — сухой хлорной известью (200 г на 1 л выделений)
ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ, ИНСТРУМЕНТОВ, ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВАТНЫХ ПРОБОК.
Посуда. Приготовленные среды разливают в стеклянную посуду (матрацы, флаконы, пробирки и т. д.). Бывшую в потреблении посуду стерилизуют, моют теплой водой с помощью ерша или щетки, после чего ополаскивают 2—3 раза дистиллированной водой и сушат. Если посуда с трудом поддается обычному мытью, ее обрабатывают в течение 30 минут хромовой смесью (на 1 л воды 50 г двухромовокислого калия, 100 г технической серной кислоты), хорошо промывая после этого водой и сушат. Посуду со следами агара, желатины и других питательных сред можно замачивать за сутки перед мытьем в растворе щелока. Для обесцвечивания не отмывшейся краски употребляют 3% раствор хлорной извести.
Посуду, применяемую для питательных сред, нельзя использовать для дезинфицирующих веществ. Примесь последних делает питательную среду негодной.
Сушить посуду следует или в сушильном шкафу, или в комнате-сушилке с температурой до 50° и хорошей вентиляцией.
Ватные пробки. Сухие пробирки, колбы, флаконы, бутыли перед стерилизацией закрывают ватными пробками, которые готовят следующим образом. Кладут на стол продолговатую четырехугольную пластинку ваты соответствующей величины, загибают внутрь все четыре края (рис.1) так, чтобы получилась ленточка, по ширине равная длине пробки, и скатывают валик по диаметру пробирки или колбы. Ватную пробку можно обертывать кусочком марли в один слой. Края марли связывают снаружи над пробкой ниткой.
РИСУНОК 1
Пастеровские пипетки. Стеклянную трубку диаметром 5—6 мм вносят в пламя горелки, нагревают до размягчения стекла и, вынув из пламени, аккуратно растягивают концы трубки в разные стороны.
Микробиологические петли. Берут отрезок платиновой или нихромовой проволоки (10—12 см. длиной) и при помощи пинцета на одном конце делают петлю диаметром 4-5 мм. Затем один конец стеклянной палочки сильно расплавляют на большом огне и к нему припаивают заготовленную вышеуказанным образом проволоку. Вместо стеклянной палочки часто используют специальный держатель. Стерилизуют непосредственно перед работой в пламени горелки.
Стеклянный шпатель. Стеклянную палочку необходимой толщины вводят в пламя горелки, нагревают до размягчения, конец обжимают предварительно нагретыми плоскогубцами, сгибают два раза, образуя треугольник. Стерилизуют перед работой в пламени горелки.
Физиологический раствор. На 1 л дистиллированной воды берут 8,5 г поваренной соли, растворяют и фильтруют через бумажный фильтр. Затем разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием.
Пробирки, колбы, матрацы и другие емкости для культивирования микробов, перед стерилизацией закрывают ватными пробками, а иногда дополнительно заворачивают в бумагу.
Чашки Петри заворачивают в бумагу по одной или помещают в большую закрывающуюся емкость и автоклавируют.
Пипетки. В микробиологической лаборатории широко пользуются пипетками. Пипетки бывают пастеровские и градуированные. Первые не имеют делений, и расчет жидкости при работе с ними ведется на капли; вторые имеют деления, и количество вытекающей из них жидкости определяется более точно. Отсчитывание измеряемой жидкости производится по делениям сверху вниз (так, например, если нужно градуированной пипеткой в 5 мл отмерить 3,5 мл, то набирают жидкость до 0, а затем выливают до 3,5).
При подготовке к стерилизации в верхний, широкий конец пипетки вкладывают кусочек ватки, которая в дальнейшем будет служить фильтром в случае вытекания суспензии из пипетки в грушу. Пипетки заворачивают в бумагу или помещают в закрываемый цилиндр. После работы пипетки погружают в стерилизующий раствор на 2-3 см. выше уровня насасывания бактериальной суспензии.
ЗАНЯТИЕ 2. Бактериологический анализ: основные этапы. Питательные среды: классификация, приготовление и состав. Методы взятия проб. Посев микрофлоры воздуха.
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1. Приготовление питательных сред: МПА, Эндо
2. Взятие проб микрофлоры воздуха в разных помещениях.
3. Знакомство с работой аппарата Кротова.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ – ИЗУЧЕНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ ТОГО ИЛИ ИНОГО ОБЪЕКТА. При проведении бактериологического анализа можно выделить три основных этапа: 1) взятие пробы; 2) выделение чистых культур; 3) идентификация выделенных культур. Все эти этапы предполагают те или иные действия с микроорганизмами, культивирование которых производят с использованием питательных сред.
Питательная среда – субстрат, содержащий все необходимые для развития микроба компоненты и отвечающий определенным требованиям (см. ниже). Выращивание микроорганизмов в искусственных условиях получило название культивирование.
Питательные среды делятся по назначению, происхождению и консистенции.
По происхождению:
естественные и искусственные, выделяют в особую группу синтетические среды, их готовят из химически чистых веществ: солей, углеводов, аминокислот и др., взятых в определенных соотношениях.
По консистенции:
жидкие: мясная вода, МПБ, бобово-пептонный бульон и др.
полужидкие: готовятся на основе жидких путем добавления 0,25% агара.
плотные: МПЖ, МПА (к жидкой среде добавляется 10-15% желатины или 1,5-2% агара).
По назначению:
Простые (обычные) - применяются для выращивания большинства м.о.: МПБ, МПА, МПЖ и др.
Элективные - пригодные для выращивания одного приспособленного к данным условиям вида м.о. Сопутствующие м.о. или не растут на такой среде или развитиеих сильно задерживается. Пример - щелочно-пептонная вода (для холерного вибриона); среда Эшби для азотобактера.
Дифференциально-диагностические - применяются для изучения биохимических свойств, а в особых случаях для выделения чистых культур некоторых микроорганизмов. Пример: среды Гисса - жидкие среды с углеводами; среда Эндо - плотная среда с индикатором для кишечной палочки.
ТРЕБОВАНИЯ, КОТОРЫМ ДОЛЖНА УДОВЛЕТВОРЯТЬ ВСЯКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА.
1. Содержать необходимые для микробов питательные вещества: источники азота, углерода, кислорода, водорода и неорганические соли; факторы роста;
2. Быть стерильной, т.е. не содержать никаких посторонних м.о.;
3. Быть достаточно прозрачной, что обеспечит хорошее наблюдение за характером роста культуры и теми изменениями, которые происходят в среде в результате роста микроорганизмов;
4. иметь соответствующую реакцию среды.
МЕТОДЫ ВЗЯТИЯ ПРОБ
