2020-10-11
1629
Простейшим методом взятия проб воздуха является метод седиментации или осаждения. Клетки микроорганизмов оседают из воздуха на поверхность питательной среды и дают начало колониям (клонам), используемым впоследствии как источник микробной массы. Метод используется в закрытых помещениях, где нет горизонтального перемещения воздуха. Метод позволяет оценить и качественные и количественные характеристики микрофлоры исследуемого воздуха. Для количественной характеристики можно пользоваться экспериментально установленным соотношением: на 100 см 2 за время 10 минут оседает количество бактерий, содержащееся в 10 литрах воздуха.
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
Схема посева микрофлоры воздуха методом седиментации.
Пробы воздуха в открытых местах или при низких концентрациях микроорганизмов можно забирать с помощью аппарата Кротова. Этот прибор позволяет обдувать поверхность чашечной среды равномерным потоком воздуха, с различной экспозицией.
|
|
|
Воздух можно прокачивать и через стерильный, предварительно взвешенный нитроцеллюлозный фильтр, который затем помещают в стерильную воду или физиологический раствор и готовят суспензию, смывая осевшие на него микроорганизмы.
Взятие проб различных жидких субстратов безусловно требует разнообразного методического обеспечения. Носовая слизь и вода из соседнего пруда, фекальные массы больного слона и молочнокислые продукты - в каждом случае мы должны выбирать конкретную методику, информацию о которой можно найти в соответствующих руководствах (см. список литературы).
При взятии проб, некоторые следует помнить правила:
1. НЕ ЗАРАЗИТЬ СЕБЯ.
2. НЕ ЗАГРЯЗНИТЬ ИССЛЕДУЕМЫЙ СУБСТРАТ ПОСТОРОННИМИ МИКРОБАМИ.
3. ИСПОЛЬЗОВАТЬ МЕТОДЫ, ПОЗВОЛЯЮЩИЕ В ДАЛЬНЕЙШЕМ УСПЕШНО ВЫДЕЛИТЬ ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Здесь необходимо напомнить, что чистой культурой м.о. является совокупность клеток одного вида. Очевидно, что наиболее удобным способом получения чистых культур оказывается получение клона микробных клеток из одной исходной. Таким образом, процесс выделения чистых культур сводится к выделению одной (в реальности нескольких) клетки определённого вида. Известно несколько принципиальных способов решения этой задачи, наиболее приемлемым и доступным в курсе малого практикума является метод рассева или распределения смеси клеток по поверхности той или иной плотной питательной среды - для аэробных видов; или в объёме среды – для анаэробов.
Метод рассева предложен Кохом, который рассевал суспензии клеток с помощью бактериологической петли (см. рис.№)
|
|
|
Распределяя клетки изолированно друг от друга на поверхности среды мы создаем условия для образования совокупностей клеток называемые колониями. Колонии как правило представляют собой клоны тех или иных видов клеток.
Распределять клетки по поверхности можно и с помощью стеклянного шпателя (см. рис.№), для чего на поверхность среды сначала наносят небольшое количество суспензии исследуемого субстрата, которую затем и распределяют равномерно по всей поверхности среды.
Получение колоний достаточно далеко удалённых друг от друга, что в дальнейшем позволит использовать их как источник клеток определённого вида (см. ниже), зависит от концентрации клеток в исходной суспензии. Для успешного решения этой задачи часто приходится делать рассевы в 2 – 3 повторностях.
Приготовление суспензии с той или иной концентрацией – один из основных этапов исследования жидких субстратов. Схема решения этой задачи приведена ниже.
Важно отметить что схема исследования суспензий в принципе одинакова для самых разных случаев, в том числе при изучении микрофлоры воздуха или смывов с любой поверхности.
|
|
|
| |||||||||||||
 | ||||||||||||||||
 |  |  | ||||||||||||||
Схема приготовления последовательных разведений бактериальной суспензии
3. Выделение чистых культур микроорганизмов. Посев на скошенный МПА. Изучение культуральных свойств микробов. Основные морфологические формы бактерий. Изучение нативных препаратов микроорганизмов. Препараты висячая и раздавленная капля.
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1. Приготовление скошенного МПА
2.. Отсев чистой культуры на скошенный МПА
3. Выявление культуральных признаков выросших колоний.
4. Приготовление нативных препаратов, выросших бактерий. Выявление некоторых морфологических свойств микроорганизмов.
Сделанные на прошлом занятии посевы микрофлоры воздуха, позволяют нам наглядно увидеть рост колоний на разных питательных средах (МПА, Эндо). Все выросшие колонии имеют своеобразные морфологические параметры, которые представляют значительный интерес для последующей идентификации выделенных микроорганизмов.
Выше мы уже отметили, что проведение бактериологического анализа предполагает определение видовой принадлежности выделенных культур – их идентификацию. Однако прежде необходимо получить чистые культуры микроорганизмов.
Чистой культурой микроба называется такая культура, которая состоит из особей только одного определенного вида. Во внешней среде и в организме человека микробы чаще всего встречаются в смеси с другими микробами. Для изучения свойств того или иного микроба (без чего не может быть поставлен диагноз) его нужно иметь в чистой культуре, т. е. приходится отделять его от других микробов, с которыми он смешан. Методов выделения чистых культур существует в основном три: а) посев на чашку Петри (см. выше), б) посев на элективную (избирательную) среду, в) выделение культуры из организма животного, чувствительного к тому или иному микроорганизму.
Посев в чашку Петри имеет целью получить изолированные друг от друга совокупности клеток, определенного вида, - колонии. Посев производят разными способами: либо петлей, либо стеклянным шпателем (шпатель Дригальского). Посев петлей производят следующим образом. Берут петлей небольшое количество культурального материала, легко проводят по поверхности агара нанося ряд линий. Той же петлей, не набирая материала вновь наносят штрихи на второй и третьей чашке с агаром. На первой чашке может получиться сплошной рост, тогда как на второй и на третьей наблюдается рост единичных, изолированных колоний. Каждая колония представляет обособленное скопление однородных клеток микробов. При последующем пересеве из колоний на косой агар или другую питательную среду получают чистую культуру
|
|
|
РИСУНОК111115
РИСУНОК 16
При посеве шпателем на поверхность агара наносят петлей одну каплю исследуемого материала. Затем, приоткрыв чашку, прокаленным и остуженным стеклянным шпателем размазывают каплю по всей поверхности, производя легкие поглаживающие движения во все стороны по поверхности агара. Не обжигая шпателя, им же засевают вторую и третью чашку. Для получения относительных количественных характеристик исследуемой суспензии на поверхность среды наносят мерное количество бактериальной суспензии с определенной концентрацией клеток. Для этого используют мерные пипетки. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих - изолированные колонии.
РИСУНОК 12
После посева чашки помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Отдельно выросшие колонии пересевают бактериологической иглой на свежую стерильную среду (чаще всего скошенный агар в пробирке).
Изолированные колонии анаэробных микроорганизмов получают методом глубинного посева, известного как метод последовательных разведений. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы из среды удалить кислород. Высев в пробирки производят из нескольких последовательных разведений бактериальной суспензии в стерильной водопроводной воде. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48-50° агаризованной средой вносят 0, 5-1, 0 мл одного из разведений бактериальной суспензии. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того, как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают стерильными капиллярными трубками, или простой петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.
|
|
|
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР.
Для классификации и идентификации культур выделенные микробы подвергаются детальному изучению. Характеристика данного микроба складывается из морфологических (1), культуральных (2), биохимических и серологических (3) признаков, которые позволяют его идентифицировать, т. е. определить его видовую принадлежность.
Морфологические свойства определяются путем бактериоскопии окрашенных фиксированных препаратов и изучения микробов в живом виде (препараты раздавленная и висячая капля). При микроскопировании обращают внимание на форму микроба, его расположение, размеры, наличие спор, капсул, отношение к тем или иным методам окраски.
Культуральные свойства – это морфологические свойства совокупности клеток микроорганизмов, выросшей на определенном субстрате. Обращают внимание на форму и размер колоний, их цвет, консистенцию и др.
Биохимические свойства. Для более точного определения вида применяют более тонкие исследования, т. е. изучают биохимические свойства микробов. При этом определяют отношение микроба к кислороду, его ферментативные и редуцирующие свойства, образование в культурах определенных продуктов обмена и изменение реакции среды.
Однако, прежде чем изучать морфологические свойства бактерий, обычно исследуют культуральные признаки и отсевают клетки в стерильную среду для дальнейшего культивирования. Это продиктовано тем, что для приготовления препарата приходится многократно открывать емкости, в которых развиваются колонии бактерий, а это неминуемо способствует проникновению посторонних микробов и загрязнению исследуемых культур.
Характеристика роста микробов на питательных средах
Культуральными называются морфологические свойства совокупностей клеток (колонии), выросших на той или иной питательной среде.
Морфология изолированных колоний. При изучении колоний невооруженным глазом исследуют обычно величину, форму, высоту, край, цвет и прозрачность. В особых случаях изучают и другие характеристики колоний. Для более детального изучения параметров колоний можно воспользоваться малым увеличением микроскопа. В этом случае закрытую чашку кладут на столик микроскопа донышком вверх, чтобы колонию можно было рассмотреть сквозь стекло. Иногда, в особых ситуациях, чашку можно открыть и рассматривать колонии сверху. СОБЛЮДАТЬ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.
По величине различают колонии мелкие, т. е. 1—2 мм., средние - 2—4 мм. и крупные - 4—6 мм и более в поперечнике.
По форме колонии бывают круглые, т. е. имеющие резко очерченные контуры, приближающиеся к кругу.
Колонии могут быть с неровными бухтообразными краями, ризоидные, т. е. напоминающие переплетенные корни дерева, и другие (см. рис.). Часто в лабораториях различают R-форму и S-форму колоний. Первые обычно имеют неровный край и неправильную форму, вторые напротив – ровный край и округлую форму.
Колонии могут иметь разный профиль: плоские, приподнятые, куполообразные, кратерообразные и др.
Поверхность колонии также бывает различной. У одних микробов поверхность матовая, у других—блестящая, гладкая или исчерченная, шероховатая.
Структура колоний бывает однородная, или гомогенная, т. е. имеющая однообразное строение во всех частях колонии; мелко-, средне- или грубозернистая; нитевидная, т. е. состоящая из длинных, густо переплетающихся нитей.
По прозрачности колонии различают просвечивающие, т. е. такие, через которые виден контур предметов, и непрозрачные (мутные), которые света не пропускают.
Цвет колоний может быть разнообразным. Различают колонии бесцветные или серовато-белые, желтые, оранжевые и т. д. Некоторые микроорганизмы продуцируя пигмент в среду изменяют ее окраску.
Рост микробов на косом агаре. На косом агаре рост изучают невооруженным глазом и отмечают те же характерные особенности, как и при исследовании колоний. Следует различать рост пышный, скудный и умеренный; непрозрачный, прозрачный и полупрозрачный; влажный, матовый и сухой; бесцветный, серовато-белый или с наличием того или иного пигмента.
Рост при посеве уколов в столбик среды. При росте по уколу в столбик агара обычно наблюдается форма роста по линии укола. Она может быть нитевидная с боковыми разветвлениями или без них и четкообразная. При росте на желатине отмечают еще наличие или отсутствие разжижения. Если наблюдается разжижение, то характер его может быть различным: кратерообразное разжижение, воронкообразное, в форме чулка или репы и послойное, т. е. идущее сверху, горизонтально, по направлению вниз.
Рост на жидких средах. По интенсивности роста на бульоне различают: рост обильный, умеренный и небольшой; по характеру—равномерная муть, осадок или пленка на поверхности. Осадок бывает зернистый, порошковидный, хлопьевидный, пленчатый и вязкий. Пленка на бульоне может быть очень нежной, как облачко, плотной, сухой и морщинистой.
Рост на молоке. При росте на молоке может не произойти никаких видимых изменений, и тогда рост микробов определяют путем бактериоскопического исследования молока. Большая группа микробов вызывает свертывание молока.
Рост на картофеле. На картофеле рост обычно такой же, как и на агаре, и только для отдельных микробов он может быть особенно характерным.
РИСУНОК КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
После изучения культуральных свойств необходимо отсеять небольшое количество бактериальной массы на свежую стерильную питательную среду. Обычно это скошенный агар в пробирке.
Посев на косой агар штрихом. Разлитый предварительно в пробирки МПА разогревают на водяной бане и дают остыть в наклонном положении, используя часто специальную подставку. Стерильной петлей берут из какого – либо источника(можно коснуться макушки выбранной колонии) небольшое количество клеток посевного материала. Левой рукой между большим и указательным пальцем держат пробирку с агаром почти в горизонтальном положении, чтобы во время посева в нее не попадали микробы из воздуха. Мизинцем правой руки и ладонью захватывают ватную пробку и вытаскивают ее из пробирки легкими движениями. Край пробирки слегка обжигают. Вводят петлю в пробирку до нижней кромки скошенного агара, где обычно собирается конденсационная влага. Смывают клетки в каплю воды и образовавшуюся суспензию рассевают по поверхности агара зигзагообразными движениями. После произведенного посева петлю извлекают из пробирки, обжигают ее края и закрывают ватной пробкой. Затем снова прожигают петлю в пламени горелки, чтобы уничтожить оставшихся на ней микробов.
Пересев из одной пробирки в другую показан на рисунке 13
РИСУНОК 13
Засеянные вновь пробирки помещают в термостат.
После отсева чистых культур и изучения культуральных свойств можно приступить к выявлению морфологических характеристик исследуемых бактерий
Основные морфологические признаки бактерий:
1) форма и размеры клеток;
2) взаимное расположение клеток после деления;
3) способность окрашиваться методом Грама;
4) способность образовывать эндоспоры;
5) способность продуцировать капсулу;
6) наличие жгутиков и тип жгутикования;
7) наличие запасных питательных веществ различной природы;
и другие.
ИССЛЕДОВАНИЕМИКРОБОВ В ЖИВОМСОСТОЯНИИ
Нативные препараты приготовленные по методике «раздавленная» и «висячая» капля позволяют очень быстро выявить некоторые морфологические параметры клеток: наличие жгутиков, форму клетки, наличие запасных питательных веществ, наличие чехлов и дополнительных оболочек и т.д. Особенно информативны такие препараты при использовании фазово-контрастной микроскопии.
Часто представляет определённый интерес исследование микробных клеток именно в нативном состоянии, так как фиксация препаратов(см. ниже) приводит к разрушению многих структур в клетке.
Раздавленная капля. На середину предметного стекла наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала; эту каплю накрывают покровным стеклом, осторожно закладывая его пинцетом, что бы в жидкости не образовалось пузырьков воздуха. Удачно сделанная капля заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, но при этом жидкость не выступает за края покровного стекла. Если требуется рассматривать препарат продолжительное время, то края покровного стекла предварительно смазывают вазелином.
Висячая капля. Каплю исследуемого материала наносят на середину обезжиренного покровного стекла. Затем покровное стекло быстро поворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло с углублением («лункой») в середине. Капля должна свободно свисать в углубление, несоприкасаясь с его дном и краями (рис.17). Края выемки на предметном стекле следует предварительно смазать вазелином, таким образом, капля оказывается герметически закрытой во влажной камере и защищенной от высыхания.
Если исследованию подвергается плотный материал, то его предварительно эмульгируют с физиологическим раствором в стерильной пробирке или на стерильном часовом стекле, откуда затем и берут часть материала для приготовления висячей капли.
Различают движение поступательное, качательное, вращательное и т. д. При исследовании живых микробов следует отличать активную подвижность бактерий, свидетельствующую о наличии у них невидимых жгутиков, от пассивного молекулярного (броуновского) движения, свойственного всем взвешенным в жидкости мелким частицам
РИСУНОК 17
Нативные препараты микроорганизмов очень удобно изучать используя фазово-контрастное микроскопирование. Методика работы с такими микроскопами (или приспособлениями) приведена в некоторых практических руководствах (см. список литературы), а также в инструктивных материалах, прилагаемых к каждому микроскопу.
Размеры микроорганизмов можно измерить с помощью объект- и окуляр-микрометров, технологию работы с которыми можно найти в инструкции по пользованию этими приборами.
4. Методы выявления и изучения морфологических свойств микробов. Микроскопия в светлом поле. Методы приготовления и окрашивания фиксированных препаратов. Методы приготовления и окрашивания фиксированных препаратов. Простые и сложные методы окрашивания препаратов.
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1. Подготовка стёкол для приготовления фиксированных препаратов.
2. Приготовление мазков из колоний бактерий выделенных из воздуха.
3. Фиксация препаратов.
4. Окраска простым и сложным (по Граму) методами.
5. Изучение морфологических свойств в готовых препаратах.
Морфологические свойства микроорганизмов можно обнаружить используя разные методы микроскопирования. Наиболее доступным является использование светового микроскопа. Для этого готовят различные препараты. С нативными препаратами мы знакомились на предыдущем занятии. Для подробного изучения целого ряда морфологических свойств бактерий используют фиксированные препараты окрашенные тем или иным методом.
Исследование микробов в окрашенном состоянии
Изучение морфологии микробов в окрашенном состоянии является наиболее распространенным в микробиологии методом. Этот метод имеет много достоинств:
- позволяет изучить морфологические особенности микробов и дает возможность найти различия между ними, а иногда даже точно определить изучаемый микроорганизм;
- удобен в практической работе, так как значительно легче производить исследование, пользуясь убитыми микробами, чем живыми (особенно при изучении патогенных микроорганизмов);
- легко доступен благодаря простоте техники окрашивания.
Приготовление окрашенного препарата включает:
а) приготовление мазка; б) высушивание мазка; в) фиксацию; г) окраску.
Препараты приготовляют на совершенно чистых предметных стеклах. Стекло может быть признано чистым, если помещенная на него капля воды легко расплывается по поверхности, а не принимает шаровидную форму или распадается на отдельные капельки.
Очистка стекол производится следующим образом: новые стекла кипятят в 1% растворе соды, после чего промывают водой, затем слабой соляной кислотой и вновь водой. Стекла, бывшие в употреблении, сначала помещают на 2 часа в концентрированную серную кислоту (или в смесь 100 частей серной кислоты и 50 частей двухромовокислого калия на 1000 частей воды). После чего кипятят в щелочи (сода, поташ, едкая щелочь, зола), а затем тщательно промывают водой. Вымытые стекла хранят в склянках с притертой пробкой в 96° спирте или же, вынув из спирта и, вытерев досуха, сохраняют сухими в закрытых склянках.
Очень простой способ очистки вымытого стекла — натереть его кусочком мыла и вытереть досуха ватой или фильтровальной бумагой.
Приготовление мазка. Мазок должен быть тонким, так как только при этом условии он удобен для изучения микробов; необходимо также, чтобы мазок имел определенную форму и размеры
РИСУНОК 9
Материал в мазке должен быть распределен равномерно в центре и на периферии, ибо такое распределение материала значительно облегчает и ускоряет его изучение. Хорошо приготовленный тонкий мазок должен быть размером 1—2 см2, круглой или овальной формы,
Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и помещают в нее исследуемый материал. Если препарат приготовляют из культуры на плотной среде, то, соблюдая правила асептики, из пробирки берут петлей немного материала и погружают в каплю, слегка растирая в ней, а остаток культуры в петле сжигают на пламени горелки. Остудив петлю, приступают к изготовлению мазка: сначала краем петли культуру равномерно размешивают в капле, а затем, положив петлю всей плоскостью, равномерными круговыми движениями распределяют каплю на площади, составляющей примерно 1/3 предметного стекла. (Иногда препарат может быть небольшим и тогда на одном стекле умещается несколько препаратов)
Если препарат изготовляют из жидкой питательной среды, тогда берут каплю культуры петлей (полное ушко петли) или пастеровской пипеткой и, поместив каплю на середину сухого чистого стекла, равномерно распределяют ее в форме мазка (рис.10).
После приготовления мазка петлю тотчас же, не выпуская из рук, прожигают на пламени горелки, а пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором.
Из материала, взятого у больного (гной, мокрота), удобно делать мазки следующим образом: материал прокаленным и остуженным пинцетом или петлей наносят на середину предметного стекла, затем плотно прикрывают его другим предметным стеклом, помещая его так, чтобы осталась свободная левая треть нижнего стекла, и правая треть верхнего стекла. Взяв за свободные концы оба стекла, раздвигают их в стороны обеими руками: получаются два равномерных больших мазка (рис, 11).
Мазок из крови приготовляется иначе. Прикоснувшись предметным стеклом (недалеко от его левого края) к выступившей при уколе капле крови, получают небольшую каплю на стекле и быстро, чтобы не дать крови свернуться, делают мазок. Для этого стекло кладут на горизонтальную поверхность и придерживают левой рукой; правой рукой к капле придвигают под углом 45° шлифованное стекло, по краю которого равномерно растекается капля. Тотчас же, плотно прижимая шлифованное стекло в том же положении под углом, продвигают его налево по предметному стеклу, получая равномерный мазок (рис.).
Высушивание. Препарат высушивают при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает равномерно и быстро.
Рис. Приготовление мазка из клеток крови или гноя.
РИСУНОК 10
РИСУНОК 11
Рис.. Приготовление мазка с помощью предметного стекла.
Если же высушивание препарата замедлено, то препарат подогревают, держа стекло мазком вверх, в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Это нужно производить крайне осторожно, не допуская перегревания мазка, так как при этом может произойти слишком быстрое и грубое свертывание белков в протоплазме микробов, что нарушит их структуру. Если препарат высушен не полностью, то при фиксации он окажется также испорченным; если высушиваемые препараты содержат заразный материал, их накрывают стеклянным колпаком, особенно летом, во избежание переноса микробов мухами и порчи самого препарата.
Фиксация. Фиксация препарата имеет целью: 1) убить микробов и сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; 2) прикрепить мазок к стеклу, чтобы он не смывался при дальнейших манипуляциях; 3) сделать микробов более восприимчивыми к окраске, там как убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. При фиксации следует предупреждать грубые изменения нормальной клеточной структуры и избегать образования ложных структур (артефактов).
Способов фиксации существует много. Наиболее простым, пригодным почти для всех объектов и самым распространенным в микробиологии является фиксация жаром—нагреванием на пламени горелки. Большим и указательным пальцами препарат берут за край стекла мазком вверх и несколько раз проводят через наиболее горячую часть пламени горелки (на границе светлой и темной его части). При этом рука, которая держит препарат, описывает трижды круг диаметром 25 см.
Вся манипуляция занимает 5—6 секунд, причем препарат подвергается действию пламени не более 2 секунд. Быстрота и кратность проведения препарата через пламя регулируются ощущением жжения: если препарат хорошо зафиксирован, то стекло при легком прикосновении им к тыльной поверхности левой руки тотчас по окончании фиксации слегка обжигает кожу.
При излишнем перегревании мазок портится, вследствие сильного изменения структуры клеток; недостаточная же фиксация не достигает цели, так как мазок смывается при последующей обработке.
В ряде случаев (например, при исследовании мазка крови, изучении тонких структур клетки простейших и спирохет) фиксация жаром оказывается слишком грубой. Тогда прибегают к фиксации препарата жидкостями. При этом фиксатор наливают на мазок или препарат погружают в сосуд с фиксирующей жидкостью на определенное время, а затем высушивают. Для этого можно пользоваться одним из следующих способов фиксации:
а) этиловым спиртом в течение 10—15 минут;
б) метиловым спиртом в течение 2—3 минут;
в) ацетоном в течение 5 минут;
г) смесью равных объемов этилового спирта и эфира (по Никифорову) в течение 10—15 минут.
Можно также применять для фиксации пары осмиевой кислоты или формалина (несколько секунд).
Окрашивание мазков. Окрашивание микробов не является механическим процессом проникновения краски в микробную клетку. Механизм окраски микробов следует рассматривать как процесс физико-химический. Соединение микроба с краской является в большинстве случаев весьма стойким, не поддается разрушению или простому вымыванию водой; нередко различные виды микробов по-разному реагируют с одними и теми же красками, что свидетельствует о неодинаковом химическом составе их цитоплазмы. В ряде случаев различные составные части микробной клетки избирательно окрашиваются разными красящими растворами. Наиболее пригодными для окраски микробов оказались анилиновые краски, главным образом основные и нейтральные. Кислые краски менее пригодны.
Окраска мазка производится после фиксации. Если мазок тонкий и трудно определить, на какой стороне стекла он находится, достаточно подышать на стекло, чтобы мазок явственно выступил, тогда как вся поверхность стекла, где мазка нет, равномерно запотевает. Можно также слегка поцарапать мазок петлей: от нее останется след.
Количество краски должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка; достаточно нескольких капель краски, наливаемых при помощи пипетки. По истечении срока окрашивания краску сливают с препарата и промывают его легкой струёй воды. При этом со стекла смывается только лишняя краска; краска же, адсорбированная микробами, остается. Оставшуюся на стекле воду осторожно удаляют, или отсасывая ее краем фильтровальной бумаги, или слегка прижимая кусочек бумаги к мазку. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим, так как остаток воды образует с кедровым маслом, нанесенным на мазок, эмульсию, мешающую микроскопированию.
ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МИКРОБОВ
В лабораторной технике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Простым методом окраски называют окраску препарата одной какой-либо краской. К таким методам относится окраска разведенным фуксином или щелочной метиленовой синькой.
Окраска разведенным фуксином. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на пламени горелки. Затем на охлажденный препарат на 1—2 минуты наливают разведенный фуксин. Краску промывают водой и препарат высушивают.
Окраска щелочной метиленовой синькой. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на огне. На остывший мазок наливают метиленовую синьку на 2—3 минуты. Краску смывают водой и препарат высушивают. При окраске синькой дифференцируются ядро и цитоплазма, а потому при окраске материала (гной, экссудат и т. д.) целесообразнее употреблять метиленовую синьку.
СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
При сложных методах окраски микробов на один и тот же препарат воздействуют несколькими растворами. К сложным методам относится окраска по Граму, Циль-Нильсену, по Нейссеру и т. д
Окраска микробов по методу Грама (Кристиан Грам, 1884). Все микробы по их отношению к окраске по методу Грама делятся на две группы:
а) грампозитивные, или грамположительные;
б) грамнегативные, или грамотрицательные.
Различное отношение к окраске по Граму зависит от разницы в физическом и химическом строении самих бактерий. Для окраски по классическому методу Грама необходимы следующие растворы
1) карболовый генцианвиолет;
2) раствор Люголя (йод кристаллический 1 г, йодистый калий 2 г и дистиллированная вода 300 мл; йод и йодистый калий смешивают и растворяют в 5 мл воды, а затем добавляют остальную воду);
3) спирт 96°;
4) разведенный фуксин
Техника окраски по Граму следующая. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, по размеру равный сделанному мазку. На эту бумажку наливают раствор генцианвиолета на 1—2 минуты. Сливают краску с бумажкой и, не промывая препарат водой, наливают на 1—2 минуты раствор Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на 1/2—1 минуту наливают 96° спирт (при этом препарат надо покачивать). Промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты). Сливают краску, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Видоизмененный способ Грама (по А. Синеву). 1. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумажки, пропитанной 1 % спиртовым раствором генцианвиолета.
2. Наносят на бумажку 2—3 капли воды и оставляют на 2 минуты.
3. Снимают бумажку пинцетом и наливают раствор Люголя на 1—2 минуты.
4. Обесцвечивают спиртом (10—30 секунд).
5. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты).
Образующийся красящий комплекс генцианвиолет + йод окрашивает клетки в фиолетовый цвет. Если клетки не обесцвечиваются спиртом то они сохраняют эту окраску и являются грамположительными (Гр+). Если же при обесцвечивании спиртом клетки теряют красящий комплекс – они считаются грамотрицательными (Гр-).
Окраска кислотоустойчивых микробов. Способы окраски кислотоустойчивых микробов основаны на их способности окрашиваться сильно красящими растворами красок при нагревании. При последующем действии слабых кислот они не обесцвечиваются. Благодаря такой обработке, кислотоустойчивые микробы могут быть дифференцированы от других бактерий. Наиболее употребительна окраска по Циль-Нильсену. Техника окраски следующая.
1) На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на которую наносят карболовый фуксин и препарат окрашивают при нагревании до появления паров, после чего оставляют краску еще на несколько минут и дают препарату остыть
2) Сливают краску и промывают препарат водой.
3) Обесцвечивают 5% серной кислотой (10—30 секунд).
4) Промывают водой.
5) Промывают чистым спиртом 10—15 секунд.
6) Спирт смывают водой.
7) Докрашивают синькой Леффлера в течение 3—5 минут.
Обесцвечивание препарата можно также произвести 3% солянокислым спиртом.
При этом методе окраски туберкулезные микробы окрашиваются в рубиново красный цвет, а другие, некислотоустойчивые микробы — в синий цвет.
Окраска спор. Способ Ожешко. На краю предметного стекла делают мазок из культуры, просушивают его и, не фиксируя, погружают на 2—3 минуты в чашку с кипящей 1% соляной кислотой, которая действует в качестве протравы. (Иногда соляную кислоту наносят на препарат и прогревают в пламени горелки до появления паров). После этого мазок промывают водой, обсушивают, фиксируют и красят карболовым фуксином через фильтровальную бумагу с подогреванием. Затем препарат обесцвечивают 5% серной кислотой и докрашивают дополнительно метиленовой синькой в течение 3—5 минут: споры, стойко прокрасившиеся фуксином, окрашены в яркокрасный цвет; вегетативные тела бактерий, обесцветившиеся в результате воздействия на фуксин серной кислоты, окрашены в дополнительный синий цвет.
Негативные способы окраски препаратов. При этих способах исследуют микробов в неокрашенном виде, в то время как весь фон препарата окрашен каким-либо веществом, которое при приготовлении мазка распределяется на стекле вокруг микробов, но не адсорбируется ими. На окрашенном фоне ярко выделяются неокрашенные тела микробов, с точно обрисованными контурами.
Способ Бурри. Исследуемый материал смешивают с тушью; следовательно, микробы рассматриваются на черном фоне. Мазок приготовляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней — каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно, но быстро (чтобы не дать им высохнуть) перемешивают. Из полученной смешанной капли приготовляют мазок обычным способом. Когда мазок высохнет, его фиксируют в пламени горелки и рассматривают его с иммерсионной системой. Микробные клетки обнаруживаются в виде ярко освещенных телец на темном фоне. Для ознакомления с техникой окраски по Бурри можно приготовить мазок из зубного налета, где всегда имеется много разнообразных микробов. В каплю воды, помещенную у края предметного стекла, погружают небольшой кусочек зубного налета, взятого простерилизованной и остуженной петлей у шейки зуба, и равномерно эмульгируют его в капле. Затем рядом с каплей воды помещают каплю туши. Обе капли тщательно смешивают петлей и из этой смеси делают мазок подобно мазку из капли крови. При микроскопировании наблюдается характерная флора зубного налета.
Окраска жгутиков. Приготовление мазка для окраски жгутиков производится с соблюдением некоторых предосторожностей. Платиновой петлей только прикасаются к поверхности 12—20-часовой агаровой культуры, но петлей не проводят по поверхности агара; затем платиновую петлю вносят в пробирку с 2—3 мл стерилизованной водопроводной воды и, не взбалтывая, держат неподвижно в воде 1—2 минуты. Вынув петлю, пробирку оставляют стоять 15 минут для более равномерного распределения микробов в воде. Каплю такой суспензии наносят на совершенно чистое предметное стекло, обработанное по специальному способу. Препараты фиксируют на огне и окрашивают специальными способами, причем перед окраской обрабатывают протравой, которая усиливает действие краски.
Выявление жгутиков свидетельствует, прежде всего, о способности микроорганизмов к активному движению. Лишь в исключительных случаях есть надобность окрашивать жгутики для решения вопроса о принадлежности к тому или иному виду. Поэтому о подвижности микробов обычно судят используя методы посева в различные среды, как правило, полужидкие. Это и быстрее и проще.
Окраска по Романовскому-Гимза. Краска Романовского-Гимза — смесь азура (органическая краска, получаемая из метиленовой синьки), эозина и метиленовой синьки. Будучи в растворе синего цвета, она окрашивает клеточную плазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий—в красно-фиолетовый цвет.
Окраска по Романовскому-Гимза является одним из основных методов при изучении морфологии простейших кровепаразитов, спирохет, а также при исследовании форменных элементов крови.
Способ применения. К 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции непосредственно перед окраской препарата прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с водой). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Качество окраски зависит от свойств воды и надо проверять ее реакцию.
Приготовленные фиксированные и окрашенные препараты микроскопируют с помощью различных объективов: сухих или погружных (иммерсионных). Методики работы с микроскопом приведены в приложении 3.
На фиксированных препаратах изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток после деления, наличие спор, наличие капсулы, наличие запасных питательных веществ, способность красится методом Грама и другие морфологические свойства микробов.
5. Микрофлора воздуха, воды и почвы. Приготовление последовательных разведений почвенной суспензии. Посев бактериальной суспензии штрихом и методом «сплошной газон».
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1.
2. Приготовление последовательных разведений почвенной суспензии.
3. Посев суспензии методом сплошной газон.
4. Приготовление и использование накопительных сред.
РАСПРОСТРАНЕНИЕ МИКРОБОВ В ПРИРОДЕ
Микробы являются организмами, широко распространенными в природе. Они вездесущи - убиквитарны. Мириады их находятся в почве, воде, атмосфере. Живут микробы и в симбиозах с животными, растениями и человеком.
Изучение вопроса о распространении микроорганизмов в природе имеет значение с гигиенической и эпидемиологической точки зрения. Биоценотическая значимость микробов известна давно, однако, лишь в последние 20 – 30 лет проблемы участия микроорганизмов в функционировании экосистем получили соответствующий приоритет в исследованиях.
МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ
Наиболее благоприятные условия для своего развития микробы находят в почве и воде. Количество микробов в почве очень велико. В 1 г почвы содержится от нескольких тысяч до нескольких десятков миллионов микробов. Характер этой микрофлоры разнообразный. Наряду с бактериями гнилостного разложения, нитрифицирующими микробами и бродильными грибками, встречаются и болезнетворные виды. Среди последних надо отметить бациллы газовой гангрены, столбняка, сибирской язвы. Многие исследования последних лет показывают, что почва является благоприятной средой обитания и для таких возбудителей как бактерии чумы, сальмонеллеза, листериоза и др.
Микробы в почве распределяются неравномерно. Меньше их на поверхности, с глубиной количество их увеличивается. Главная масса микробов находится на глубине 10—20 см. По мере дальнейшего углубления количество их становится все меньше и меньше, а на глубине 4 м располагается граница их максимальной концентрации. Ниже мы рассмотрим свойства некоторых групп почвенных микроорганизмов.
МИКРОФЛОРА ВОЗДУХА
Несмотря на то, что воздух является неблагоприятной средой для развития микробов, последние находятся в нем постоянно. В воздух микробы попадают с поверхности почвы с пылью и с различными выделениями живых существ. Наиболее частыми обитателями воздуха являются дрожжи, грибки, споровые палочки и пигментные микроорганизмы.
В воздухе жилых помещений и, в особенности в окружении больных могут находиться и болезнетворные микробы (туберкулезная палочка, палочка дифтерии, возбудитель скарлатины и др.).
Количественный и качественный состав микрофлоры воздуха зависит главным образом от количества пыли, которое переносится воздушными течениями. Количество же пыли зависит от ряда причин (высота и широта местности, время года, влажность, населенность и т. д.). Воздух лесов, полей, лугов, а также воздух над водными пространствами вдали от населенных пунктов отличается сравнительной чистотой. Наоборот, в городах с большим уличным движением, в жилых помещениях (особенно в местах большого скопления людей) воздух может содержать большое количество микроорганизмов.
Атмосферные осадки способствуют очищению воздуха от микробов. Для ориентировки в относительном содержании микроорганизмов в воздухе можно пользоваться следующим методом. Чашки Петри с застывшим агаром выставляют в открытом виде на разных высотах в помещении на различные сроки (от 1/4 ДО 1 1/2 часов), затем закрывают и ставят в термостат; спустя сутки или двое подсчитывается число выросших колоний.
МИКРОФЛОРА ВОДЫ
Вода в противоположность воздуху является средой, пригодной не только для существования, но и для размножения микробов. В силу этого и количество микробов в воде будет значительно больше, чем в воздухе. В воду микробы попадаю главным образом из почвы, с отбросами и с выделениями человека и животных, а также из воздуха. В воде встречаются самые разнообразные микроорганизмы, главным образом сапрофиты, но в некоторых случаях встречаются и болезнетворные микробы (возбудители брюшного тифа, холерный вибрион и др.)
Оценка годности воды для употребления осуществляется рядом физических, химических и биологических методов. Мутные и окрашенные воды, воды, пахнущие сероводородом, аммиаком и другими веществами, не могут быть использованы для питья без соответствующей обработки. Примесь в воде различных химических веществ: (аммиак, сероводород, соли азотной и азотистой кислоты), свидетельствует о том, что данный водоем загрязнен органическими веществами, и в первую очередь в таком случае надо иметь в виду испражнения или промышленные отходы.
В санитарно-гигиенической практике не только качественный, но и количественный учет микроорганизмов в воде помогает определить пригодность ее к употреблению. Так, вода, содержащая до 500 микробов в 1 мл, считается хорошей, до 1 000 микробов — посредственной, а при наличии нескольких тысяч микробов — плохой.
Исследования природных субстратов, таким образом, предполагает определение количества клеток, содержащихся в том или ином объеме субстрата. Число клеток в единице объема можно посчитать различными методами. Иногда, для определения абсолютного числа, проводят прямой счет клеток в исследуемой среде. Однако это отнимает много времени и сил. Часто достаточно относительной количественной оценки. Одним из методов такой оценки является метод высева на плотные среды.
Определение количества клеток методом высева на плотные среды (чашечный метод). Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. При этом исходят из того, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Чашечный метод особенно широко используется для определения количества микроорганизмов в почве и других естественных субстратах. Однако следует учитывать, что для микроорганизмов, образующих цепочки или другие скопления клеток, результаты по определению их числа будут всегда несколько занижены.
Работа этим методом включает три этапа:
- приготовление разведений,
- посев на плотную среду в чашки Петри,
- подсчет выросших колоний.
Особенности выполнения этих этапов приведены в приложении 4.
В качестве исследуемого субстрата в данном случае может быть не только вода или почва, но и воздух. Для этого на стерильный бумажный фильтр (предварительно взвешенный) осаждают клетки, прокачивая определенное количество воздуха. Принципиальная схема такого исследования показана на рисунке ХХ. Затем фильтр помещают в стерильную воду, где клетки смывают в раствор. Приготовленную суспензию исследуют, как было описано выше.
Рис. ХХ. Схема осаждения на фильтр микрофлоры воздуха.
6. Физиологические особенности микроорганизмов. (среды гисса, пбде, сиб, жидкие среды, антибиотики)
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1. Пересев культуры на свежую питательную среду.
2. Приготовление бактериальной суспензии.
3. Посев исследуемой культуры на диагностические среды (экспресс-системы СИБ, ПБДЕ)
Процесс идентификации микроорганизмов предполагает изучение различных физиолого-биохимических свойств. Среди таких параметров микробов наиболее часто изучают
- способность клеток утилизировать или трансформировать разные субстраты: углеводы, аминокислоты, спирты и др. (ферментативные реакции);
- наличие на поверхности клеток специфических молекулярных структур (серологические реакции);
- соотношение количества разных нуклеотидов в ДНК (геносистематика);
- способность поражать тот или иной организм (биопробы).
Для изучения ферментативной активности используют дифференциально-диагностические среды (см. выше). Как правило, это жидкие среды, разлитые в пробирки. Исследуемую культуру обычно засевают в пробирки со скошенного МПА.
Чтобы сделать пересев из одной пробирки в другую, обе пробирки, т. е. ту, из которой производится посев, и ту, которая подлежит засеву, захватывают вместе и держат большим и остальными пальцами левой руки. Вынимают сначала пробки из обеих пробирок, набирают материал из пробирки с культурой и вносят в пробирку с жидкой средой, тщательно стерилизуют края пробирок в пламени горелки и закрывают их. (рис. 13). Работая с жидкими средами внимательно следить за тем, чтобы они не вылились из пробирок.
РИСУНОК 13
Пересев из жидкой среды можно делать также при помощи стерильной пастеровской пипетки.
Использование классических диагностических сред, каковыми являются среды Гисса, трудоемко и дорого, так как они готовятся из большого количества натуральных продуктов. Кроме того, культивирование на таких средах занимает много времени, из-за их значительного объема. В связи с этим, в лабораторной практике постоянно стоит проблема удешевления и ускорения процесса биохимической идентификации. В числе концептуальных предложений, позволяющих, так или иначе, решать названную проблему, можно назвать разработки отечественных авторов. В Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии были разработаны и внедрены так называемые системы бумажные индикаторные – СИБ. системы бумажные представляют собой диски или полоски бумаги, пропитанные соответствующими диагностическими питательными средами в строго определенном количестве. Диски помещают в определенный объем физиологического раствора, где среда растворяется. В образовавшийся микрообъем жидкой среды засевают исследуемую культуру микроорганизма. Результат фиксируют по изменению окраски среды.
Другой отечественной тест-системой для идентификации является, изготовленная в том же институте пластина биохимическая дифференцирующая (ПБД). Тест-система представляет собой панель, изготовленную из нейтральной полимерной пленки с лунками, на дно которых внесены соответствующие субстраты – диагностические среды. Субстраты вносят в лунки в жидком виде, а затем высушивают и стерилизуют. Панель закрывается крышкой и удобна для транспортировки. В лаборатории готовят бактериальную суспензию в физ. растворе, несколько капель, которой вносят в каждую лунку, где образуется, таким образом, микрообъем питательной среды, засеянной микроорганизмами. Результаты учитывают по изменяющейся окраске среды.
Серологическое исследование основано на специфическом взаимодействии иммунной сыворотки с соответствующим антигеном (взвесью микробов в физиологическом растворе). Реакция иммунных сывороток зависит от наличия в них специфических иммунных антител.
Форма проявления взаимодействия антигена с антителом различна и зависит от структуры антигена и от среды, в которой происходит их соединение. Внешнее проявление реакции может быть в виде склеивания микробов, т. е. агглютинации, преципитации или осаждения, растворения микробов (бактериолиза) и т. д. Указанные иммунологические реакции специфичны и весьма чувствительны, поэтому серологический метод исследования получил широкое применение.
Реакции иммунитета широко применяются с диагностической целью и при производстве лечебных сывороток и вакцин.
Методы постановки серологических реакций, как правило, вполне посильны и опубликованы в инструкциях по использованию агглютинирующих сывороток.
Методика постановки биопроб сложна не только технологически, но и в связи с необходимостью работать с разными животными, что допускается после специальной подготовки.
