Методика проведения занятия и методические указания по теме. Тема 11. Использование в вирусологии культур клеток

Тема 11. Использование в вирусологии культур клеток. Культивирование вирусов в культуре клеток

Задание к следующему занятию.

Подведение итогов занятия.

Контрольные вопросы:

1. Преимущества и недостатки метода культивирования вирусов на культурах клеток.

2. Типы клеточных культур.

3. Классификацию и требования, предъявляемые к питательным средам и растворам.

4. С какой целью используют культуры клеток и тканей в вирусологических исследованиях.

Цель занятия: ознакомиться с методом получения первично трипсинизированной культуры клеток из тканей куриного эмбриона.

Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневной инкубации, чашки Петри, колбочки по 100 мл, фильтр марлевый, центрифужные пробирки, пробирки стерильные с резиновыми пробками, пипетки, воронки, трипсин, среда 199, раствор Хенкса, центрифуга, магнитные мешалки, магнитики, камеры Горяева, микроскопы, лед, овоскоп, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя. Метод культуры клеток заключается в том, что от убитого животного как можно быстрее после клинической смерти берут ткань или клетки и до наступ­ления биологической смерти помещают их в соответствующие питательные сре­ды и условия, обеспечивающие поддержание процессов жизнедеятельности. Наряду с множеством других преимуществ метод культуры тканей относительно дешев и поэтому может быть использован массово.

11.1 Метод трипсинизации. Культуры клеток из куриных эмбрионов методом трипсинизации готовят по следующей методике:

1. Подготовка куриных эмбрионов

а) овоскопирование

б) дезинфекция

в) извлечение, измельчение

г) промывание в растворе Хенкса.

2. Трипсинизацию проводят на магнитной мешалке в течение 10 минут подогретым до 35°С 0,25% раствором трипсина. Колбу помещают на тающий лед. Оставшиеся кусочки заливают новой порцией трипсина и трипсинизируют до истощения ткани.

3. Отделение клеток от трипсина.

Взвесь клеток в трипсине центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендируют в небольшом количестве ростовой питательной среды.

4. Подсчет клеток.

Определяют количество клеток в 1 мл суспензии в камере Горяева. Считают клетки в 10 больших квадратах, среднее умножают на 22 000. Подсчет клеток необходим для того, чтобы получить хороший монослой. Для клеток куриного эмбриона оптимальная доза 250-500 тысяч клеток в 1 мл суспензии.

5. Посев клеток.

Вносят в каждую пробирку по 1 мл клеточной суспензии в ростовой среде. Пробирки закрывают резиновыми пробками, помещают на подставку под углом 5-7° и ставят в термостат при +37°.

Рост клеток будет заметен через 12-14 часов после посева, но хороший монослой образуется только через 2-3 дня. Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста.

Метод холодной трипсинизации (рис. 28) используют для диспергирования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят, кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:

а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 – 5 мм, ткань многократно (3–4 раза) промывают раствором Хенкса до полного освобождения от эритроцитов;

б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добав­ляют 0,25%-ный раствор трипсина, в котором перемешивают ткань 10 – 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают и выбрасы­вают;

в) в колбу добавляют свежий раствор трипсина и помещают ее на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не было разбрызгивания и вспенивания жидкости. Перемешивание продолжают в течение ночи (12–16 ч) при 4-6°С;

г) утром суспензию фильтруют через 2 – 3 слоя марли или сетку из нержаве­ющей стали в центрифужные флаконы;

д) клетки осаждают центрифугированием при 400 –600 об/мин 20 – 30 мин. Трипсин удаляют;

Рисунок 28. Последовательность приготовления почечной культуры клеток. 1 – измельчение коркового слоя; 2 – трипсинизация; 3 – осаждение диспергирован­ных клеток центрифугированием, 4 – подсчет живых клеток в гемоцитометре; 5 – диспергирование клеток в среде выращивания, во флаконах Ру; 6 – снятие первично­го монослоя культуры клеток с помощью трипсиноверсеновой смеси, процедура повторного осаждения и подсчета клеток; 7 – суспендирование клеток в среде роста, розлив по пробиркам и инкубация их в стационарных условиях до заражения вирусом

е) осадок клеток промывают в ростовой среде центрифугированием. Отмы­тые клетки ресуспендируют в ростовой среде, определяют концентрацию, дово­дят ее до посевной и разливают суспензию клеток в сосуды для культивирования.

11.2 Номенклатура культур тканей и клеток. В 1966 г. предложена унифицирован­ная терминология для тканевых культур животных. Основные положения ее при­водятся ниже.

Культура тканей (tissue culture; Gewebekultur) – сборное понятие, обознача­ющее систему, в которой клетки, ткани или органы сохраняют жизнеспособ­ность или способность размножаться in vitro более 24 ч. В зависимости от вида биологического объекта различают: культуру клеток (cell culture; Zellkultur) – термин, который обозначает рост клеток in vitro и включает в себя также рост единичных клеток (клетки в культуре не образуют ткань); культуру тканей или органов (tissue or organ culture; Gewebe oder organ Kultur) – термин, который обозначает поддержание роста тканей, зачатков органов или их частей in vitro при сохранении их дифференцировки, структуры и (или) функции.

Эксплантат (explant; Explantat) – вырезанный кусок ткани или органа, ис­пользуемый для культуры in vitro.

Однослойная культура клеток, монослой (monolayer; einschkhtiger Zellrasen) – клетки, растущие в один слой на определенной поверхности. Клеточный штамм (cell strain, Zellstamm) выводится из первичной культуры или из клеточной линии путем селекции или клонирования клеток со специфи­ческими свойствами (маркерами) Эти маркеры должны сохраняться во время дальнейшего культивирования При описании штамма необходимо ха­рактеризовать его свойства, например наличие определенного хромосомного набора, специфических антигенов, устойчивости к определенному вирусу.

Подштамм (substrain, Unterstamm) можно получить из штамма путем изоля­ции единичной клетки или группы клеток, обладающих свойствами, которыми не обладают остальные клетки штамма

Клон (clone, Klon) – популяция клеток, полученная путем деления (митоза) одной клетки Клон не всегда однороден и не должен быть таким, поэтому нельзя использовать термины «клон» или «клонированный» для обозначения однород­ной популяции клеток.

Клонированный штамм или линия (clone strain or line, geklonter Stamm oder geklonte Lime) – штамм или линия, выведенные из одного клона.

Время генерации клеток (cell generation time; Zellgenerationszeit) – интервал между последующими делениями клеток. Лучше всего определять с помощью микрофотографии. Термин этот не идентичен термину «время удвоения популя­ции».

Время удвоения популяции (population doubling time; Verdopplungszeit). Термин касается всей популяции и определяет время, за которое количество клеток воз­растает, например с 1 х 10⁶ до 2 х 10⁶.

Абсолютная эффективность посева (absolute plating efficiency; absolute Aussaateffektivitat) – процент единичных клеток, которые после внесения в сис­тему для выращивания (посев) образуют колонии. Обязательно всегда сообщать общее число введенных клеток, тип посуды и условия (род питательной среды, температура, открытая или закрытая система, атмосфера, С0₂ и т. д.).

Относительная эффективность посева (relative plating efficiency; relative Aussaateffektivitat) – процент посеянных клеток, образующих колонии по отно­шению к контролю, в котором за 100 % принимается абсолютная эффектив­ность посева. Необходимо всегда сообщать общее число введенных клеток, ус­ловия выращивания и абсолютную эффективность посева в контроле.

Самостоятельная работа студентов.

а) изучение техники получения первичных трипсинизированных культур по методике.

б) получение первично-трипсинизированных культур клеток из куриных эмбрионов.