Лекция 3. Культуры клеток растений – продуценты Биологически активных соединений

Мышьяковистые воды, как правило, относятся к углекислым (Синегорское, Дарыдагское, Чвижепсинское и др.). Мышьякосодержащие воды встречаются на Камчатке, Кавказе и Сахалине.

Азотные воды применяют при заболеваниях нервной системы, опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой системы, кожных, аллергических, гинекологических заболеваниях, эндокринных расстройствах, заболеваниях органов дыхания и кишечника.

7. Мышьяковые воды – природные воды, содержащие более 0,7 мг/л мышьяка. Принадлежат к относительно редким разновидностям минеральных вод. Различают воды мышьяковые, содержащие мышьяковую кислоту. Они обычно представляют собой кислые сульфатные воды рудничного типа.

Используют для питья, ингаляций, ванн и орошений. Мышьяк оказывает влияние на ферментные процессы, активизирует обменные процессы, улучшает тканевое дыхание. В результате применения мышьякосодержащих вод стимулируется кроветворение, функции сердечно-сосудистой системы, желудка, кишечника, иммунной системы.

Воды этого типа используют для лечения больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, болезнями крови, кожи, нервной системы, опорно-двигательного аппарата, желудка, кишечника, некоторыми эндокринными заболеваниями.

8. Пресные органосодержащие воды типа «Нафтуся» - выявлены в России в Поволжье (курорт Ундоры), в Коми, Центральном районе и Прибайкалье. Они нормализуют деятельность почек и мочевыводящих путей и применяют для лечения почечнокаменной и мочекаменной болезней.

Контрольные вопросы и задания

1. Дайте определение понятия «минеральные источники» и охарактеризуйте

их виды.

2. Дайте определение понятия «минеральные воды», перечислите и

охарактеризуйте шесть основных типов минеральных вод.

3. Раскройте сущность основных показателей минеральных вод:

минерализация, ионный и газовый состав, температура, кислотность и радиоактивность.

4. Перечислите основные типы минеральных вод, географию их распространения (основные месторождения), виды их использования и при каких заболеваниях рекомендуется применение тех или иных типов минеральных вод.

При производстве более 25% современных лекарств используется растительное сырье. Растения являются продуцентами многих БАВ – соединений, способных оказывать влияние на биологические процессы в организме. К таким соединениям принадлежат сердечные гликозиды, сапонины, стерины, каратиноиды, полифенолы, алкалоиды, витамины, хиноны, а также вещества, обладающие специфическим ароматом, вкусом и окраской.

Биологически активные вещества принадлежат к продуктам вторичного обмена, которые называют вторичными метаболитами или вторичными продуктами биосинтеза. В настоящее время известно более 100 000 вторичных метаболитов, продуцируемых растениями. Многие из них являются практически, экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности.

До недавнего времени основным источником биологически активных (БАВ), лекарственных и ароматических веществ служат дикорастущие и выращиваемые на плантациях растения. Основная доля коммерческих поставок (80-90%) обеспечивается сбором дикорастущих растений.

Культуры клеток и тканей, полученные in vitro, как и клетки интактного растения, могут синтезировать вторичные метаболиты, по качественному и количественному составу подобные или идентичные веществам, растений. Это является предпосылкой замены части природного сырья и способствует сохранению ценных растений в природе.

Практически важные результаты использования культуры клеток и тканей были получены в 60-х годах ХХ века. Было показано, что такие БАВ, как диосгенин, гармин и виснагин синтезируются культурами клеток в тех же количествах, как в исходном растении. Скрининг, проведенный среди большого количества растений, показал, что, во-первых, круг БАВ, синтезируемых в культурах, свидетельствует об огромном синтетическом потенциале и разнообразии вторичного метаболизма; во-вторых, относительно небольшое число их пригодно для использования в промышленности.

В настоящее время собрана большая коллекция клеточных культур растений из различных семейств, синтезирующих вторичные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный – источник панаксозидов, диоскорея дельтовидная – стероидных гликозидов, раувольфия змеиная – продуцент антиаритмического алкалоида аймалина и т.д. Установлено, что клетки тиса ягодного синтезируют вещество-таксол, которое является антираковым препаратом. Проводятся большие научно-технологические исследования по культивированию клеток и тканей лекарственных растений in vitro.

Преимуществами использования культур клеток растений для производства БАВ являются:

  • сохранение природных ресурсов;
  • высокая скорость получения биомассы (женьшень корень – 1 г в год, культура клеток – 2 г/л/сут);
  • управляемость процесса;
  • независимость от сезона;
  • экологическая чистота;
  • для штаммов-суперпродуцентов более высокое содержание продукта.

Этапы получения штаммов-продуцентов:

  • выбор объекта;
  • выбор экспланта;
  • получение каллусной культуры;
  • анализ наличия продукта;
  • получение суспензии;
  • анализ наличия и количества продукта;
  • оценка рентабельности;
  • получение активно растущих и синтезирующих клонов;
  • оптимизация условий выращивания;
  • выбор метода выделения продукта;
  • применение элиситоров;
  • иммобилизация;
  • масштабирование.

Источниками культур клеток, которые представляют интерес как сырье для производства БАВ, могут быть растения, не растущие в наших условиях, а также растения, потребность в которых высока, а ареал распространения ограничен, и запасы невелики. По этим критериям были введены в культуру in vitro женьшень, раувольфия, барвинок, диоскорея, василистник, коптис. Особое значение имеют виды, фармакологическая ценность которых чрезвычайно высока, а содержание вторичных метаболитов низкое, например тисс – продуцент противоопухолевого препарата таксола. Вторичный метаболит паклитаксел содержится в коре этого дерева. Для лечения одного пациента необходимо уничтожить минимум три столетних дерева.

Биологическая и биосинтетическая продуктивность индивидуальных растений может существенно различаться. При использовании наиболее продуктивных растений можно рассчитывать на получение клеточной культуры с активным биосинтезом БАВ.

У растений вторичные метаболиты накапливаются, как правило, в запасающих органах. Однако предпочтение для введения в культуру тканей органов запаса искомого продукта не имеет экспериментального подтверждения. Интенсивность роста и содержание продуктов вторичного метаболизма в культурах клеток, полученных из разных органов одного растения, показывает отсутствие каких-либо закономерностей. Поэтому для введения в культуру лучше выбирать меристематические ткани, от которых легче получить культуру тканей.

Исходные штаммы, как правило, имеют низкий уровень биосинтеза, который, кроме того, падает с возрастом культуры. Поэтому встает вопрос об улучшении клеток-продуцентов и их стабильности, что связано с использованием генетических подходов.

Одним из них является генетическая трансформация растительных клеток. Показано, что использование Ri-плазмиды почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes приводит к образованию «бородатых корней», опухолеподобных образований с высоким уровнем биосинтеза вторичных соединений. Трансформация культур клеток с помощью Ti-плазмиды другого вида агробактерии Agrobacterium tumefaciens также в некоторых случаях приводит к повышению продуктивности.

Другой путь – спонтанный и индуцированный метагенез, клонирование и селекция продуктивных мутантных клеточных линий. Культуры клеток растений представляют собой гетерогенные популяции, при клонировании которых можно выделить индивидуальные линии со своими характеристиками, включая интенсивность роста и биосинтеза вторичных метаболитов, причем клоны могут различаться по этим признакам в десятки раз.

(Терминология: клон – потомство одной клетки, штамм – культура, полученная от одного растения или выделенная в процессе селекции).

В результате использования спонтанного и индуцированного мутагенеза и селективных систем был выделен ряд перспективных клеточных клонов и штаммов-продуцентов БАВ, причем стабильность их сохраняется на протяжении многих лет.

Факторами, влияющими на рост клеток и их продуктивность по вторичным метаболитам, являются компоненты среды выращивания, прежде всего качественный и количественный состав фитогормонов, углеводов, ряда минеральных солей, рН среды, температура выращивания, степень аэрации, способ и интенсивность перемешивания, условия освещения. По значению для продуктивности культур факторы можно выстроить в следующий ряд: минеральный состав среды, количество и соотношение фитогормонов, соотношение нитратного и аммонийного азота, качественный и количественный состав углеводов, степень аэрации культуры.

Добавление в среду выращивания предшественников синтеза вторичных метаболитов может увеличить содержание целевого продукта. Экономически этот подход может быть выгоден в случае невысокой стоимости предшественников.

В настоящее время общепринято, что многие вторичные метаболиты являются компонентами защитной системы растения. Открытие элиситоров – сигнальных молекул, запускающих ответ растительного организма на атаку патогенов – стало ключевым моментом в повышении продуктивности культур клеток. Установлено, что некоторые экзометаболиты грибов, фрагменты их клеточных стенок, ряд микробных токсинов, различные тяжелые металлы, а также УФ облучение и ультразвук способны увеличивать синтез и накопление вторичных метаболитов в растениях. В качестве мощных элиситоров могут выступать жасмоновая кислота и ее производные. К настоящему моменту известно множество примеров интенсификации синтеза вторичных метаболитов в культурах клеток растений под действием жасмонатов. В последнее время в качестве еще одного мощного элиситора рассматривается фитотоксин коронатин.

Для крупномасштабного культивирования растительных клеток для препаративного получения вещества вторичного синтеза используют специальные металлические и стеклянные ферментаторы (биореакторы) различной конструкции (с мешалкой или барботажного типа). Режим ферментации периодический (накопительный) или непрерывный, главным образом хемостатный. Биосинтез продуктов вторичного синтеза проводят в ферментерах объемом от 0,1 до 63 м3 и более. Аэрацию культуральной биомассы осуществляют стерильным воздухом через барботер. Воздух стерилизуют, как правило, путем фильтрации на двух-трех последовательно установленных фильтратах. В ходе культивирования клеток растений регулируют температуру (25-37°С), рН и окислительно-восстановительные потенциал.

Процесс культивирования ведут до тех пор, пока идет интенсивный синтез целевого продукта и в среде не будут исчерпаны питательные вещества. При определении конца культивирования необходимо учитывать данные микроскопического контроля состояния культуры, отсутствие постоянной микрофлоры, концентрацию основных питательных веществ, биомассы, целевого продукта, рН. Процесс развития продуцента БАВ в ферментаторах проходит при строгом контроле всех стадий, очень точном выполнении разработанного регламента условий накопления БАВ. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотной среды рН, степени аэрации и скорости работы мешалки. Учитывая потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источников углевода, азота, калия, магния, фосфора, аминокислот, витаминов), контролируется наличие компонентов питательной среды.

Особое внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через суспензионную культуру–продуцент БАВ часто происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития штамма-продуцента БАВ в ферментере. Основная причина появления большого количества пены – высокая вязкость питательной среды, обусловленная обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментерах при получении биомассы используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специальные синтезированные вещества (силиконы, диазобутилкарбомил и другие соединения).

Новым подходом, направленным на увеличение выхода вторичных метаболитов, является иммобилизация клеток и тканей растений. Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории:

  1. Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате. Например, клетки Catharanthus roseus, Digitalis lanata в альгинатных, агарозных шариках, в желатине и т.д. Метод предполагает обволакивание клеток одной из различных цементирующих сред – альгинат, агар, коллаген, полиакриламид.
  2. Адсорбция клеток на инертном субстрате. Клетки прилипают к заряженным шарикам из альгината, полистирола, полиакриламида. Метод применялся в экспериментах с животными клетками, а также клетками Saccharomyces uvarum, S. cerevisiae, Candida tropicalis, E. coli.
  3. Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения об экспериментах с различными линиями клеток человека, эритроцитами крови барана, адсорбированными на покрытой белком агарозе.
  4. Ковалентное связывание с другим инертным носителем типа КМЦ. Очень редко применяется, известна удачная иммобилизация для Micrococcus luteus. В основном проводились эксперименты по иммобилизации клеток животных и микроорганизмов.

В последнее время интерес к иммобилизации клеток растений значительно возрос, это связано с тем, что иммобилизованные клетки имеют определенные преимущества перед каллусными и суспензионными культурами при использовании их для получения вторичных метаболитов.

Существует положительная корреляция между накоплением вторичных метаболитов и степенью дифференцировки в культуре клеток. Изучение содержания алкалоидов, накапливаемых многими растениями in vitro, показало, что компактные, медленно растущие культуры клеток содержат алкалоиды в больших количествах, чем рыхлые, быстро растущие культуры. Организация клеток необходима для их нормального метаболизма. Наличие организованности в ткани и ее последующее действие на различные физические и химические градиенты – четкие показатели, по которым различаются высоко- и низкопродуктивные культуры. Очевидно, что иммобилизация клеток обеспечивает условия, приводящие к дифференциации, упорядочивает организацию клеток и способствует тем самым высокому выходу вторичных метаболитов.

Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ:

1. Клетки, иммобилизованные в или на инертном субстрате, образуют биомассу гораздо медленнее, чем растущие в жидких суспензионных культурах.

Какова же связь между ростом и метаболизмом? При чем здесь клеточная организация и дифференцировка? Предполагают, что эта взаимосвязь обусловлена двумя типами механизмов. Первый механизм основан на том, что рост определяет степень агрегации клеток, оказывая косвенное влияние на синтез вторичных метаболитов. Организация в данном случае является результатом агрегации клеток, а достаточная степень агрегации может быть получена только в медленно растущих культурах. Второй механизм связан с кинетикой скорости роста и предполагает, что «первичный» и «вторичный» пути метаболизма по-разному конкурируют за предшественники в быстро и медленно растущих клетках. Если условия среды благоприятны для быстрого роста, то в первую очередь синтезируются первичные метаболиты. Если быстрый рост блокирован, то начинается синтез вторичных метаболитов. Таким образом, низкая скорость роста иммобилизованных клеток способствует высокому выходу метаболитов.

2. Кроме медленного роста иммобилизация клеток позволяет им расти в тесном физическом контакте друг другом, что благоприятно отражается и на химических контактах.

При использовании иммобилизованных клеток относительно легко осуществляется обработка их химическим веществами, индуцирующими высвобождение требуемых продуктов. Это также снижает ингибирование по типу обратной связи, которое ограничивает синтез веществ вследствие накопления их внутри клетки. Культивируемые клетки некоторых растений, например, Capsicum frutescens выделяют вторичные метаболиты в окружающую среду, а система иммобилизованных клеток позволяет отбирать продукты без повреждения культур.


Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:  



double arrow
Сейчас читают про: