Краткое описание чертежей, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени

На фиг. 1 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Inonotus obliquus (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром.

На фиг. 2 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Ganoderma resinaceum (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром.

На фиг. 3 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Fomitopsis pinicola (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром.

На фиг. 4 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Fomes fomentarius (1%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром.

На фиг. 5 представлена оценка выживаемости с помощью графика Каплана-Мейера (ограничение продукта), демонстрирующая долю пчел, выживших с течением времени, когда им давали экстракты Fomes fomentarius (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром.

На фиг. 6 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц в контрольной популяции и у пчел, которым давали экстракты мицелия Inonotus obliquus (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром в нулевой момент времени, через одну неделю и две недели.

На фиг. 7 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц в контрольной популяции, которую кормили только водой с сахаром, и у пчел, которым давали экстракты мицелия Ganoderma resinaceum (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией в нулевой момент времени, через одну неделю и через две недели.

На фиг. 8 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц у пчел, которым давали экстракты мицелия Fomitopsis pinicola (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром в нулевой момент времени и через одну неделю.

На фиг. 9 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц у пчел, которым давали экстракты мицелия Schizophyllum commune (0,1, 1 и 10%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром в нулевой момент времени и через две недели.

На фиг. 10 представлен линейный график, демонстрирующий пороговое значение числа циклов для вируса черных маточников с течением времени в контрольной популяции и у пчел, которым давали экс

- 9 032759 тракты мицелия Inonotus obliquus (1%) и Ganoderma resinaceum (1%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром.

На фиг. 11 представлен линейный график, демонстрирующий пороговое значение числа циклов для вируса черных маточников с течением времени в контрольной популяции и у пчел, которым давали экстракты мицелия Inonotus obliquus (1%) и Ganoderma resinaceum (1%) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром.

Наилучший способ(ы) осуществления изобретения и промышленная применимость

Пчелы все больше сталкиваются с новыми антропогенными стрессовыми факторами. На протяжении сотен миллионов лет грибы эволюционировали, чтобы бороться с вирусами, бактериями и другими грибами; эволюционировали, чтобы инфицировать паразитов, в том числе насекомых; эволюционировали их ферменты для разрушения токсинов; эволюционировали их вещества для активации таких процессов. Это означает, что они обеспечивают потенциальный пищевой клад из соединений, полезных для защиты пчел и других опылителей от таких угроз, включая множество пртивовирусных, антибактериальных, противогрибных и антипротозойных соединений и соединений, пригодных для активации пищеварительной системы, системы детоксикации и иммунной системы пчел.

Без связи с какой-либо теорией автор изобретения полагает, что экстракты мицелия грибов специфически модулируют, индуцируют и повышают экспрессию осуществляющих детоксикацию и ксенобиотических метаболизирующих генов, в частности активируя все классы генов детоксикации, увеличивая метаболизм пестицидов в средней кишке, функционируя в качестве питательных веществ, регулирующих иммунные процессы и процессы детоксикации, активируя иммунные, метаболические и пищевые каскады (каскады метаболизма липидов и глюкозы) и активируя гены, кодирующие противомикробные пептиды. Более того, отдельные виды грибов поддерживают микробиом полезных микроорганизмов в пищеварительной системе пчел, и их совместимость является важным мостом между видами, согласуя действие полезных, вызывающих гниль древесины грибов с полезными микробами, находящимися в задней кишке пчел. Ожидается, что экстракты по настоящему изобретению будут пребиотиками для природного микробиома в органах пищеварительной системы пчел, а также будут сообщать противовирусную пользу, которая будет вносить вклад в увеличение продолжительности жизни пчел, их колоний и их совокупную функциональность. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является фермент мицелия медицинских грибов Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sakei, Leuconostoc lactis, Streptococcus thermophiles и бактериофагов для получения пригодных для употребления в пищу и экологически пригодных композиций, полезных для микробиома пчел, животных (людей).

Поскольку пчелы подвергаются атаке множества патогенов (клещей, вирусов, микроспоридий, простейших, горбаток) и воздействию переносимых воздухом загрязнителей, поиск надежной универсальной платформы защиты для способствования поддержанию иммунной защиты пчел имеет первостепенное значение. Например, разработка способов для получения композиций с использованием внеклеточных экссудатов мицелия отдельных видов грибов, включая, но не ограничиваясь ими, Stropharia rugosoannulata и другие представители Strophariaceae, Fomitopsis pinicola и другие представители Fomitopsidaceae, и Metarhizium anisopliae и другие представители Clavicipitaceae, может помочь предотвратить синдром краха колонии. Также ожидается, что многие другие виды базидиомицет и аскомицетов будут обеспечивать сходную пользу в ходе исследования пользы полезных для пчел экссудатов, секретируемых выращенным в лаборатории чистым культивируемым мицелием.

Что касается экстрактов грибов, экстракты мицелия являются предпочтительными относительно экстрактов плодового тела, поскольку гифа продуцирует внеклеточные экссудаты, которые обогащены доступной водой, маслами, полисахаридами, аминокислотами, витаминами группы В, кумаринами, пкумаровой кислотой, фенолами и полифенолами, а также эргостеринами, ферментами, кислотами, в том числе жирными кислотами, антибактериальными веществами и противовирусными веществами. Отдельные гифальные нити мицелия испускают комплексные запахи, которые улетучиваются в воздух, в то время как плодовые тела имеют тенденцию к наличию питательной ценности, но не имеют обширных экспонированных областей клеточной поверхности, как и та же масса мицелия. Плодовое тело гриба состоит из гифы с уплотненными клетками, наслоенными друг на друга, так что только малая часть массы мицелия в плодовом теле экспонирована в атмосферу. Таким образом, плодовые тела грибов лишены признака запаха мицелия, из которого они образованы. Поскольку эти внеклеточные экссудаты могут быть без труда растворены в раствор, эти экссудаты могут быть более эффективно включены в улучшающие средства, такие как лепешка из пыльцы, растворы сахара или вода, спреи опрыскивания пчел или спреи для опрыскивания листьев, и являются лучшими аттрактантами для пчел и других насекомых, чем плодовые тела грибов. В настоящее время это не является очевидным специалистам в областях микологии и энтомологии, внимание которых было сосредоточено в большей степени на плодовых телах и спорах плодовых тел, а не на мицелии.

Хотя пчелы могут искать обогащенные сахаром капли, выделяющиеся из мицелия гниющего дерева, 100% экстракты - то, что пчелы собирают - являются чрезмерно концентрированными и токсичными в большинстве видов в их природной форме, чтобы быть полезными. Даже в 10% концентрации боль

- 10 032759 шинство исследованных экстрактов были токсичными. Таким образом, если бы пчелы поглощали эти капли в природе, они бы, вероятно, заболели, преждевременно погибли и не получили пользы. Автор изобретения и его коллеги открыли, что, когда лабораторно чистые экстракты культур разбавляли в высокой степени до 10%, сохранялась некоторая токсичность, но когда они их разбавляли до 1% или 0,1% или менее, продолжительность жизни существенно увеличивалась, особенно среднем возрасте, когда рабочие пчелы находятся на пике их активности и являются наиболее продуктивным в их заготавливании и сборе пыльцы. Аналогично, когда экстракты разбавляли, наблюдали противовирусную пользу, и в то же время происходило увеличение продолжительности жизни в случае нескольких исследованных видов грибов. Это является особенно важным, поскольку снижение нагрузки патогеном оказывает общую суммарную пользу для качества общего состояния здоровья и эффективности улья. Путем объединения экстрактов, оптимизированных для противовирусной активности, с экстрактами, оптимизированными для увеличения продолжительности жизни, ожидается большая польза, чем в каждом случае отдельно. В результате комбинации с пользой для продолжительности жизни пчелы могут быть более продуктивными в качестве собирателей, в качестве пчел-кормилиц, ухаживающих за потомством, и в качестве помощников, контролирующих гигиену, с меньшей заболеваемостью и улучшенной способностью выдерживать экзогенные стрессовые факторы. В сущности, функции, которые пчелы выполняют внутри улья и снаружи во внешней среде, существенно усиливаются при использовании способов и композиций, описанных в рамках настоящего изобретения.

Экстракт чистой культуры лабораторного мицелия на стерилизованных субстратах существенно отличается от встречающейся в природе формы мицелия - структурно, количественно и качественно. Более того, выращивание чистой культуры мицелия, например на рисе, который является ненативным субстратом, без многочисленных других совместно встречающихся микробов, обитающих на естественным образом разлагающейся древесине, возможно обеспечивает получение другого вещества, чем экссудаты из разлагающейся древесины, в которой присутствует множество других организмов (грамм гниющей древесины в природе содержит сотни других микроорганизмов, включая бактерии, простейшие, другие грибы, совместно обитающие с или на разлагающем древесину мицелии). Таким образом, экссудаты обычного мицелия в природе, содержащего множество организмов, значительно отличаются, и маловероятно, что они обеспечат пчелам такую же противовирусную пользу и пользу увеличения продолжительности жизни, что и польза, которая наблюдается в случае специально разбавленных чистых культуральных экстрактов, полученных из мицелия, как описано в настоящем описании. Иными словами, для пчел являются полезными некоторые изменения и манипуляции, проводимые автором настоящего изобретения, вне природы: экссудаты из мицелия чистой культуры должны быть значительно разбавленными до определенных концентраций, чтобы они демонстрировали пользу. После обнаружения того, что первоначальные экстракты являются токсичными, большинство исследователей отказались бы от этого направления исследований. Действительно, когда автор изобретения предложил идею энтомологам и микологам, квалифицированным в данной области, они не торопились поддерживать контакты с автором изобретения, поскольку они ожидали токсичности и не хотели приносить вред пчелам. Первоначальные результаты, по иронии, подтвердили их предположения. Некоторые даже назвали идеи автора изобретения бессмысленными и не хотели их рассматривать далее.

Как и в ботанике, можно ожидать, что экстракты грибов могут быть более эффективными, чем отдельные компоненты или лекарственные средства. См., например, Elfawal et al., Dried whole-plant Artemisia annua slows evolution of malaria drug resistance and overcomes resistance to artemisinin, Proc Natl Acad Sci USA 112(3):821-6 (2015).

Только недавно в исследовании было открыто, что мицелий имеет больше включенных генов, чем плодовые тела грибов, которые в итоге образуются из него. Как было отмечено Li et al., 2013, Кодирующие белки гены экспрессировались на более высоком уровне в мицелии или на первоначальных стадиях по сравнению с генами в плодовых телах, Li et al., Complete mitochondrial genome of the medicinal mushroom Ganoderma lucidum. PLoS ONE 8(8):e72038 (2013). doi:10.1371/journal.pone.0072038.

Более того, подобная сети структура мицелия позволяет эпигенетическую эволюцию штаммов, которые могут быть преобразованы для испускания веществ, предназначенных специально для принесения пчелам пользы. Такие улучшения ожидаются автором настоящего изобретения в качестве способа повышения привлекательности для пчел штаммов и композиций и увеличения пригодности для способствования преодолению пчелами CCD.

В сущности, автор изобретения обнаружил новое питательное вещество, которое обогащено широким набором кумаринов, фенолов и полифенолов; и противовирусными, противогрибными, антибактериальными и антипротозойными средствами и большим разнообразием специализированных метаболитов, таких как антиоксиданты и антимутагены, которые образуются в результате расщепления мицелием зерен или древесины и являются привлекательными для пчел и поддерживают их защиту от стрессовых факторов и заболеваний. Экстракты грибов, используемые в медицине для здоровья человека, имеют неожиданную пользу для здоровья пчел, включая снижение количества вирусов и увеличение продолжительности жизни. Действительно, вклад грибов в прополис и мед, а также в пыльцу усиливает иммунную систему пчел и, более того, человека на определенных, фундаментальных, комплексных уровнях. Автор

- 11 032759 изобретения отмечает, что экстракты мицелия, выращенные на древесине, инокулированной зерном, предположительно будут содержать больше полифенолов, кумаринов и соединений, которые активируют гены детоксикации и иммунитета у пчел, в противоположность экстрактам мицелия, выращенным посредством жидкостной ферментации.

Поскольку природе могут потребоваться десятилетия и даже тысячелетия для установления новых полезных ассоциаций, вследствие того, что пчелы неспособны достаточно быстро реагировать на последние внедрения новых гербицидов, пестицидов, фунгицидов и митицидов, то можно запустить - заходя вперед эволюции - этот процесс, отдав этим полезным видам грибов главную роль в путях биологии и биохимии пчел для поддержания их иммунной защиты и предупреждения CCD. Химический состав мицелия грибов является сложным и вариабельным в и среди различных типов, семейств и родов грибов, что является признаком, который делает экстракты грибов хорошим средством защиты против быстро эволюционирующих паразитов и патогенов.