Культивирование. Возбудитель — строгий анаэроб, оптимальное разрежение — 4 -10 мм ртутного столба, температурный оптимум 36-37° С, рН 7,4-7,6, лучше растет на средах с добавлением крови, сыворотки крови, глюкозы, лактозы, дрожжевого экстракта.
Первичные посевы обычно производят на плотные питательные среды с последующей отвивкой культур на жидкие среды. Из жидких сред посев материала проводят на среду Кита-Тароцци, мартеновский бульон, лучше с добавлением 10% стерильной крови барана или крупного рогатого скота, а также 0,4% глюкозы. Используют тиогликолатный бульон с К-геминовой добавкой. Посев на жидкие среды целесообразно проводить при малом содержании возбудителя в исследуемом материале, с последующим высевом культуры на плотные среды. Для лучшего роста в жидкие питательные среды добавляют 0,4% глюкозы и витаминную
К-геминовую добавку, сыворотку крови. Перед использованием среды обязательно выдерживают в течение 20-30 минут в кипящей водяной бане и охлаждают до 37-38° С. По данным Я.Р.Коваленко, F.necrophorum растет в стерильной сыворотке крови. Из полужидких сред может быть использован ПЖА по Муромцеву с добавлением 5-10% сыворотки крови, 2% глюкозы, 0,2% цистина.
|
|
В качестве плотных сред для первичной изоляции возбудителя применяют глюкозный (1%), сывороточный (10-20%) агар, глюкозо-кровяной агар. Агаровые среды готовят непосредственно перед посевом или выдерживают перед использованием в течение 6-24 часов в анаэробных сосудах. С целью стимуляции роста возбудителя рекомендуется добавлять дрожжевой экстракт, витамин К и гемин. Для создания условий анаэробиоза используют общепринятые методы: культивирование на жидких средах под слоем вазелинового или парафинового масла, добавление в среды редуцирующих веществ, на плотных средах в анаэростатах с удалением воздуха при помощи вакуумного насоса до необходимой степени разрежения или заменой воздуха газовой смесью (Н2 - 10%, СО2 - 5%, N2 — 85%) либо с использованием газ-пакетов (см. «Культивирование анаэробов»).
При исследовании загрязненного посторонней микрофлорой материала рекомендуют для подавления протея добавлять к агару 5,5-6% этанола (95%) перед его разливом в чашки Петри. На такой среде протей теряет способность к ползучему росту и образует округлые, выпуклые, с ровными краями колонии. Культивирование посевов проводят при 36-37° С в течение 5-7 суток, с ежедневным просмотром.
На сывороточно-глюкозном агаре через 48-72 часа инкубирования возбудитель формирует очень мелкие росинчатые колонии диаметром до 1 мм, которые через 4-5 суток достигают диаметра 2-3 мм. Колонии округлые или продолговатые, с гладкой блестящей поверхностью, ровными или слегка зазубренными краями, в центре небольшое углубление, структура мелкозернистая, цвет серовато-белый или зеленоватый до желтоватого. При выращивании на кровяных агаровых средах (кровь кролика) гемолитическая активность варьирует, гемолиз типа β или а. Колонии легко снимаются с поверхности среды и эмульгируются в физиологическом растворе. При культивировании на желточном агаре большинство штаммов проявляют липазную, но не лецитиназную активность. При посеве методом заливок в глубине глю-козного агара на 4-5-е сутки образются небольшие чечевицеобразные серовато-белые колонии. Величина и форма колоний зависят от плотности агара. В сывороточном агаре через 2-3 суток формируются непрозрачные четко контурированные колонии с видимыми под малым увеличением микроскопа отходящими нитями.
|
|
На полужидком печеночном агаре (0,15%) через 24-72 часа инкубирования возбудитель растет в виде облачка с интенсивным помутнением среды и заметным газообразованием. На мозговой среде возбудитель растет хорошо, после добавления к среде раствора сернокислого железа происходит ее почернение ввиду выделения возбудителем сероводорода. В среде Кита-Тароцци рост наблюдается через 15-48 часов инкубирования в нижних слоях питательной среды, позднее — в верхних. Через 9-
10 часов среда просветляется, на кусочках печени формируется ватообразный налет, разбивающийся при встряхивании в равномерную взвесь. Слабое газообразование отмечается только на ранней стадии роста культуры. Для улучшения роста возбудителя в среду добавляют 10% крови или сыворотки крови крупного рогатого скота или барана. В стерильной сыворотке крови F.necrophorum через 24-48 часов инкубирования растет в виде сероватых нитевидных хлопьев по всему столбику среды, с последующим формированием осадка.