Серологическая диагностика. Выделение и идентификация С.burneti

Выделение и идентификация С.burneti

Культивирование в куриных эмбрионах. Для заражения куриных эмбрионов подходит нитрированная кровь. В случае возможной контаминации материала посторонней микрофлорой тка­невый гомогенат на физиологическом растворе (1:10) обрабатывают пени­циллином (1000 ЕД/мл) и стрептомицином (500ЕД/мл) в течение 60 минут, делают контрольные высевы на МПА, МПБ. Суспензию в объеме 0,2-0,25 мл или нитрированную кровь вводят в желточный мешок (см. «Хлами­диозы»). Используют 5-7-дневные куриные эмбрионы, начиная с 4-5 су­ток яйца ежедневно овоскопируют. Павшие эмбрионы вскрывают по мере гибели, после 8 суток допускается вскрытие живых эмбрионов. При отри­цательных результатах проводят до 4-6 «слепых» пассажей. Риккетсии обнаруживают в оболочках желточного мешка в окрашенных препаратах или при помощи метода люминесцирующих антител. После адаптации штам­ма к куриным эмбрионам из ткани эмбриона можно экстрагировать антиген и идентифицировать его в серологических реакциях с иммунными сыворот­ками против фаз I и II C.burneti.

Выращивание в культуре клеток. Культивирование C. burneti может быть проведено в культуре фибробла-стов куриного эмбриона, эпителия желточного мешка, почечного эпителия и т.д. Риккетсии хорошо размножаются в клет­ках ФСЦ, Нер-2, КП, ПК, ТК, СК, трипсинизированных клетках куриных эмбрионов. С пятого дня зараженные культуры клеток исследуют путем микроскопии окрашенных мазков, в РИФ и ПЦР.

Заражение лабораторных животных. Суспензию из исходного материала (1:5) обрабатывают антибиотиками и вводят интраперитонеально морским свинкам массой 250-300 г в дозе 3-5 мл или молодым кроликам. Морских свинок ежедневно термометрируют, проводят до 3-5 «слепых» пассажей. У погибших или убитых в пе­риод лихорадки животных берут соскобы с брюшины, готовят мазки, микроскопируют, исследуют в РИФ. О результатах заражения судят по нали­чию риккетсией в препаратах. Длительное наблюдение за животными (35-40 дней) позволяет поставить диагноз на основании исследования сыворо­ток крови в РСК.

Антитела выявляются в серологических реакциях через 2-3 недели пос­ле заражения. Для этого используют РСК, ELIS А, РА. В соответствии с «Методическими указаниями по серологической диаг­ностике лихорадки Ку животных» (1996) в РФ используют реакцию дли­тельного связывания комплемента, ИФА, РСК.

Реакция связывания комплемента. В РСК применяют антиген из I фазы C.burneti. Исследуемые сыворотки крови разводят 1:10, инактивируют в водяной бане при 56-58° С в течение 30 мин. Контрольную позитивную сыворотку не инактивируют. Средой раз­ведения служит 0,85%-ный раствор натрия хлорида (рН 7,0-7,4). Берут 2%-ную взвесь эритроцитов барана, гемолизин в удвоенном титре. Комплемент разводят 1:10 и титруют в разведениях 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:50, 1:60, в присутствии антигена в рабочем разведении при общем объеме компонен­тов 0,5 мл. В опыт берут комплемент в удвоенном титре. Испытуемые и кон­трольную негативную сыворотки исследуют в разведении 1:10 (с антигеном и без него), контрольную позитивную — в разведениях с 1:10 до предельного титра. Остальные контроли проводят как обычно при РСК. Первая фаза РДСК длится 18-20 часов при 4-6° С и 20 минут при комнатной температу­ре, вторая фаза — 30 минут в водяной бане при 37-38° С. Результаты реак­ции учитывают через 18-20 часов выдерживания пробирок при 4-6° С при условии задержки гемолиза в контроле с позитивной сывороткой до ее пре­дельного титра и при полном гемолизе с негативной сывороткой.

Результат реакции оценивают как положительный при задержке гемо­лиза с испытуемой сывороткой (1:10) на 3-4 креста, сомнительный — задержка гемолиза на 1-2 креста. При сомнительных результатах сыво­ротку крови от таких животных исследуют повторно через 15-21 день. При повторном получении сомнительного или отрицательного результата животное признают здоровым.

Непрямой вариант ИФА. Используют при сенсибилизации планшет антиген для РДСК из I фазы возбудителя лихорадки Ку. ИФА по чувствительности превосходит РДСК.

Реакция микроагглютинации. При помощи данной реакции выявляют антитела в молоке (индивидуаль­ные пробы, сборное молоко), сыворотке крови. Молоко до исследования хра нят при 4-8°С или консервируют 0,1% формалинa. В качестве антигена при­меняют очищенную суспензию C.burneti в I фазе, окрашенную гематоксили­ном. Реакцию проводят в капиллярах. Капилляр заполняют молоком, затем антигеном (см. «Реакция микропреципитации»), капилляры закрепляют в пла­стилине, инкубируют при 37° С в течение 5 часов или 24 часа при комнатной температуре. В молоке, содержащем агглютинины к возбудителю, слой сли­вок приобретает сине-черный цвет — положительный результат.