Серологическая идентификация. Выделение вируса. Выделение вируса на лабораторных животных

Выделение вируса. Выделение вируса на лабораторных животных. Используют хорьков, белых крыс, но чаще белых мышей. В качестве исходного материала для выделения вируса используют ку­сочки лёгкого, трахеи, бронхиальный экссудат, носовые смывы от больных свиней.

Мышей заражают интразально под эфирным наркозом и в течение 5-
7 дн наблюдают за ними, обращая внимание на общее состояние животных. Если животные не гибнут, их уби­вают. На вскрытии отмечают изменения в лёгких. Затем проводят ещё 3-4 пассажа. По мере адаптации вирулентность вируса для белых мышей значительно возрастает, они гибнут на 4-7-й, а иногда на 14-й день после заражения.

Выделение вируса на КЭ. Испытуемый материал инокулируют в аллантоисную или амниотическую полости 9-12-сут КЭ, которые после заражения инкубируют 48-72 ч, иногда до 96 ч при температуре 37°С. Для выделения вируса обычно проводят 2-3 слепых пассажа.

Выделение вируса в культуре клеток. Культура клеток почек поросёнка - универ­сальная биологическая система, применяя которую можно выделить вирус от больных сви­ней. Для быстрой индикации вируса гриппа в 1-слойных культурах почечного эпителия по­росят используют РГАД с эритроцитами курицы, морской свинки или 0-группы человека. ГАд, положительная РГА, а также дегенеративные изменения клеток указывают на присут­ствие вируса в исследуемом материале. Вирус, вызвавший явление ГАд, должен адаптиро­ваться к КЭ и вызывать накопление ГА.

Риноцитоскопия. Со слизистой оболочки носа делают мазки-отпечатки. Положитель­ный диагноз ставят на основании обнаружения в отпечатке в первые 1-3 дн болезни большо­го количества клеток цилиндрического эпителия. Позднее содержание цилиндрических кле­ток в мазке уменьшается. Вопрос о диагностическом значении цитоплазматических включе­ний при гриппе свиней неясен; в литературе нет достаточно обоснованных сообщений.

Обнаружение вируса в РГА. При постановке РГА обычно используют эритроциты кур или морской свинки. Берут 0,5 мл носового смыва, добавляют 0,5 мл 0,5%-ной взвеси эрит­роцитов, тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч. Резуль­таты реакции учитывают общепринятым методом. Чувствительность реакции можно повы­сить, увеличив объем испытуемых смывов. РГА со смывами используют только при массо­вом заболевании гриппом, так как процент специфических реакций не превышает 30.

РСК. Все ранее выделенные эпизоотические штаммы ВГС относятся к типу А. Однако это не исключает возможности обнаружения вируса гриппа иной типовой принадлежности, поэтому тип выделенных вирусов определяют в РСК. Данную реакцию используют при вы­делении вируса, идентификация которого не удается с помощью РТГА. В этом случае в РСК с эталонными иммунными сыворотками против гриппа типов А, В и С устанавливают типо­вую принадлежность выделенного вируса. В Ленинградском институте им. Пастера предло­жена усовершенствованная методика РСК для идентификации вирусов гриппа, в которой используют иммунные типовые сыворотки морских свинок (коммерческие лошадиные типоспецифические сыворотки для этой цели непригодны). В РСК применяют две дозы ком­племента. Использование в реакции сыворотки морской свинки и аллантоисного АГ не тре­бует титрования комплемента в их присутствии, так как они не обладают антикомплемен­тарными свойствами. При идентификации вирусов гриппа РСК не заменяет РТГА, Позволяя установить типовую принадлежность штаммов, РСК не вскрывает различий между ними.

ИФ. ИФ (прямой и непрямой варианты) используют для быстрого обнаружения АГ ви­руса в патологическом материале и в биологических системах, в которых проводят выделе­ние вируса (КЭ, лабораторные животные, культура клеток). Локализация вирусного АГ ха­рактеризуется вначале нежной диффузной флюоресценцией в ядре, затем в перинуклеарной зоне. Постепенно мелкогранулярное свечение распространяется по всей цитоплазме, а внут­риядерное - ослабевает. Методика постановки ИФ общепринятая.

РТГА. Идентификацию выделенного на КЭ вируса проводят с набором штаммоспецифических сывороток с использованием эритроцитов кур. РТГА ставят по общепринятой ме­тодике. Сыворотка, задерживающая РГА до разведения не меньше четверти ее гомологич­ного титра, соответствует типу вируса. Например, РТГА со штаммами:

В данном примере штаммы № 2 и 3 принадлежат к БГС типа А и родственны штамму № 1, так как сыворотка к этому штамму нейтрализует ГА активность штаммов 2 и 3 соот­ветственно до 0,25 и 0,5 своего гомологичного титра (1:320).

РН. Ставят, главным образом, в КЭ, где хорошо размножаются вирусы гриппа. Приме­нение ее на мышах весьма ограничено ввиду того, что немногие штаммы вируса гриппа па­тогенны для мышей. РН может быть поставлена в 2-х вариантах по общепринятой методике.

ИФА. Вирусспецифические АГ выявлялись в ИФА в цитоплазме ФКЭ и клеток эпите­лия дыхательного тракта мышей в виде гранул желтого цвета. Установлена высокая чувст­вительность метода. Недавно иммуноферментная методика модифицирована. Стало возможным использовать ее для выявления ГА вируса гриппа как в составе вирусных частиц, так и в изолированном из вирионов состоянии. Модификация основана на прямой адсорб­ции вирионов гриппа и вирусспецифических белков на полистироловых гранулах. Опреде­лены параметры тест-системы для реализации ее максимальной чувствительности. Эффек­тивность выявления ГА зависит от сорбционных свойств ГА содержащих вирусных препа­ратов. Для интактных вирионов гриппа максимальная чувствительность тест-системы равна 1-2 нг ГА в образце. Разработан экспресс-вариант методики, позволяющий выявить 30-40 нг ГА в образце при полной продолжительности анализа около 4 ч.

Метод молекулярной гибридизации. Применяют для анализа носоглоточных смывов, полученных от заболевших в период эпидемиологического подъема заболеваемости грип­пом, что позволяет рекомендовать его для использования в эпизоотологическом анализе. С помощью РТГА с использованием наборов монАТ, метода ПЦР и секвенирования ее про­дуктов, продемонстрирована высокая система АГ- и генетической консервативности ГА изолятов ВГС, полученных в 1986-1991 гг.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При ретроспективной диагностике важно выяснить, отмечалась ли циркуляция вируса гриппа у животных на данной ферме. Для этого исследуют кровь 10-20 свиней на присутствие анти-ГА. Начиная с 7-10-го дня по­сле начала болезни в крови реконвалесцентов появляются AT. BHA у свиней появляются на 6-7-й день. Максимальный титр их обычно бывает между 14-м и 27-м да.

РТГА. Обнаружение анти-ГА в крови переболевших животных - наиболее простой, дос­таточно точный и пригодный метод проведения единичных и массовых исследований при диагностике гриппа. Для этого при помощи РТГА определяют сдвиг специфических AT в парных сыворотках, взятых от животных в различные сроки после переболевания. Получа­ют от каждого больного животного две пробы сыворотки: в первые дни болезни (1 проба) и в период реконвалесценции (2-я проба). Интервал между взятием 1-й и 2-й проб должен быть не менее 8-14 дн. Если в сыворотке, полученной от больных свиней в стадии выздо­ровления (через 14-30 дн после начала болезни), количество AT возросло по сравнению с исходным уровнем в 1-й сыворотке, взятой в первые дни болезни, в 4 раза и более, то это свидетельствует о том, что вспышка гриппа прошла. Анти-ГА в крови экспериментально зараженных поросят образуются во всех случаях на 8-10-й день, на 21-й день наблюдается некоторое снижение их титра, и к 40-му дню титры их в РТГА колеблются от 1:8 до 1:32.

Сыворотки перед исследованием прогревают при 60°С 30 мин, освобождают от термо­стабильных ингибиторов (обработкой СО₂) и неспецифических АГ (адсорбцией с помощью эритроцитов кур). РТГА ставят общепринятым методом с 4 ГАЕ вируса. Для удаления не­специфических ингибиторов из сывороток, содержащих AT к вирусу гриппа, в Румынии за­патентован способ обработки, в котором используют фильтрат Clostridium welchii, позво­ляющий с большей надежностью получить сыворотки без ингибиторов, но сохранившие ис­ходные концентрации специфических AT. Использование рекомбинантного вируса, устой­чивого к неспецифическим сывороточным ингибиторам, позволяет исследовать сыворотки без их предварительной обработки. При сопоставлении чувствительности РТГА и ИФА бы­ла установлена их равноценность в выявлении числа сероконверсии к вирусам гриппа, од­нако величина титров AT, по данным РТГА, была в 2 раза ниже, чем в ИФА.

РН. Ставят ее в монослойной культуре клеток, для чего используют адаптированный штамм с хорошо выраженным ЦПД. Испытуемые сыворотки инактивируют 30 мин, а для реакции используют 100 ТЦД₅₀ вируса; смеси инкубируют при температуре 37°С 30 мин. При необходимости РН ставят и на КЭ по общепринятой методике. В США РН по подавле­нию бляшкообразования вирусами гриппа Al, A2 и В в перевиваемой линии клеток почек собак оказалась в 100 раз чувствительнее, чем РНГА.

Перед постановкой реакции сыворотки разводят от 10-¹ до 10-⁸ и инкубируют с 60-160 БОЕ индикаторного вируса гриппа в течение 1 ч при 34-36°С. Затем смеси вносят в чашки Петри с культурой клеток почек собак, выращенной в среде Игла при добавлении глутамина и нормальной телячьей сыворотки. На клетки наслаивают среду покрытия (среда Игла с 50% декстрозы, 1% декстрана и 0,1% трипсина), затем чашки в течение 2-5 дн инкубируют при 34-36°С в атмосфере с 5% СО₂. К вирусу гриппа А1 чувствительна только 1-дн культу­ра, а к вирусу А2 - 2-дн культура клеток почек собак. Указанная модификация РН удобна тем, что не требует освобождения сывороток от неспецифических ингибиторов и выявляла AT в сыворотках, в которых не удавалось обнаружить AT с помощью РТГА.

РРГ. Более чувствительна, чем РТГА. Она была предложена для определения титра AT в сыворотках свиней, для чего из свежеотмытых эритроцитов цыплят готовят 10%-ную сус­пензию на фосфатном буфере рН 7,2. Вирус гриппа А, выделенный от свиней (шт.А/свинья/Висконсин/15/30), в форме аллантоисной жидкости, содержащей 1024 ГАЕ в 0,05 мл, добавляют к равному объему суспензии эритроцитов. Смесь выдерживают 10 мин при 4°С, а затем дважды отмывают и ресуспендируют. Готовят расплавленную 1,5%-ную агарозу (А-37), содержащую 0,1% азида натрия. Затем к 4,5 мл суспензии эритроцитов с адсор­бированным вирусом добавляют 1 мл комплемента и смешивают с 24,5 мл расплавленной и охлажденной до 45°С агарозой. После застывания среды вырезают луночки диаметром 3 мм. Каждую луночку заполняют исследуемой сывороткой и пластины выдерживают ночь во влажной камере при 4°С, а затем инкубируют 3 ч при 37°С. Испытуемые сыворотки перед исследованием инактивируют 30 мин при 56°С. О наличии AT к вирусу судят по образова­нию зоны лизиса вокруг луночек. Установлена корреляция титров AT в полевых и экспери­ментальных сыворотках, выявленных при использовании РРГ и РТГА.

Описанный метод прост и быстро выполним. Неспецифическая ингибиция свиных сы­вороток снимается при прогревании. РРГ оказалась более чувствительной при выявлении AT к слабоавидным штаммам вируса А/Виктория/3/75 и В/Анон/2114/76. При правильном подборе штамма вируса РРГ может быть с успехом использована для определения антинейраминидазных AT при массовых обследованиях на грипп.

РНГА. При серодиагностике гриппа эта реакция позволяет выявлять AT в значительно более высоких разведениях сывороток, чем РСК и РТГА (в 35 и 10 раз соответственно). Различия менаду показателями в РНГА и РН не превышали 1,1%. Благодаря высокой чувст­вительности РНГА давала возможность регистрировать сероконверсию раньше, чем другие серологические методы. ELISA применительно к гриппу свиней не разработан. РСК не на­шла широкого практического применения из-за трудностей, связанных с прокомплементарными свойствами сывороток свиней.

Дифференциальная диагностика. Трудность распознавания ВГС связана с тем, что вирусные респираторные болезни (инфекция Сендай, пневмонии хламидиозной природы, аденовирусная инфекция и пр.), а также микоплазмоз сопровождаются катаральными про­цессами в дыхательных путях. Атипичные формы гриппа свиней иногда могут протекать хронически и напоминают вирусную пневмонию свиней (весьма собирательный термин прошлого, под которым могут скрываться пневмонии разной этиологии). В последнее время установлено, что гриппоподобные болезни свиней могут быть обусловлены микоплазмами. Свинопоголовье может явиться как резервуаром для сохранения и возникновения эпидемических вариантов, так и промежуточным звеном в ходе эпидемического и эпизоотического процессов.