Методы специфической индикации

Биологическое накопление риккетсий и хламидий

Материалом для заражения клеточных культур служит взвесь пробы из флакона «г». Эта взвесь перед заражением культуры клеток должна быть выдержана в холодильнике при 2-4⁰С не менее одного часа (контакт пробы с антибио­тиками).

Для выявления основных видов риккетсий и хламидий исследуемым материалом заражают 8 пробирок с монослоем клеток на пластинах. Для этого из пробирок с клеточной культурой удаляют ростовую среду, вносят в пробирки ис­следуемый материал (инокулят) в объеме 0,2мл, инкубиру­ют пробирки в наклонном положении в термостате при тем­пературе 37⁰С в течение 1,5-2 ч (контакт инокулята с клет­ками), полностью удаляют инокулят из пробирок и одно­кратно промывают зараженные клетки 1,5 мл «разводящей» среды. Вносят в пробирки по 1 мл поддерживающей среды с 2% сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков.

Пробирки с зараженной культурой клеток инкубируют в термостате при температуре 37⁰С в течение двух суток.

Через 24 и 44ч из пробирок извлекают пластины с моно­слоем клеток для исследования с помощью МФА (по 4 пла­стины на каждом сроке). Отмытые и высушенные пластины приклеивают на предметное стекло и фиксируют в охлаж­денном ацетоне.

Остающуюся в пробирках после извлечения пластин культуральную жидкость используют при необходимости для постановки РНГА.

Анализ материалов пробы с помощью метода флюоресцирующих антител (МФА)

Метод флюоресцирующих антител, выгодно сочетающий принципы иммунологического и морфологического исследо­ваний с люминесцентным анализом, отличается высокой чув­ствительностью и специфичностью. В основе его лежит реак­ция между искомым антигеном и люминесцирующим имму­ноглобулином, меченым специальными красителями - флюо­рохромами. Образующийся в результате такой реакции ком­плекс антиген + флюоресцирующее антитело приобретает способность светиться в синих и ультрафиолетовых лучах спектра.

Основным преимуществом МФА является возможность быстрого выявления, изучения локализации и идентифика­ции возбудителей бактериальных, риккетсиозных, вирусных, грибковых инфекций и их антигенов в препаратах, окрашен­ных гомологичными флюоресцирующими иммуноглобулина­ми. МФА в течение 1-2 ч позволяет обнаруживать не толь­ко жизнеспособные особи возбудителей, но и мертвые клет­ки, содержащиеся в препарате.

Для специфической индикации применяют прямой метод флюоресцирующих антител в сочетании с контрастированием неспецифического свечения. С этой целью для окраски маз­ков используют смесь, состоящую из равных объемов специ­фических флюоресцирующих антител, меченных флюоресце­ин-изотиоцианатом (излучающим зеленый цвет), и контра­стирующего альбумина нормальной сыворотки (лошадиной, бычьей, кроличьей), конъюгированного с родаминовыми кра­сителями (обладающими красной люминесценцией).

Для проведения специфической индикации с помощью прямого МФА необходимы:

- наборы сухих меченных флюоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) иммуноглобулинов;

- сухой сывороточный альбумин, меченный производны­ми родамина;

- химически чистый ацетон или этиловый спирт для фик­сации мазков;

- 0,01 М фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4) с 0,87% хлорида натрия для отбывания препаратов в процессе их обработки люминесцирующими иммуноглобулинами;

- дистиллированная вода (нейтральной рН) для раство­рения сухих люминесцирующих конъюгатов и отмывания окрашенных мазков;

- 0,15 М (изотонический) - раствор хлорида натрия для приготовления рабочих разведении люминесцирующих конъ­югатов;

- нелюминесцирующее иммерсионное масло (или диме­тилфталат) и трис-глицериновая смесь для люминесцентной микроскопии;

- предметные и покровные стекла для приготовления мазков и препаратов для микроскопии;

- батарейные стаканчики для фиксации и отмывки окра­шенных препаратов;

- кюветы с крышками (влажные камеры) или чашки Петри для окраски мазков люминесцирующими иммуногло­булинами;

- пробирки, пипетки и прочая посуда для подготовки рабочих разведении люминесцирующих конъюгатов и обра­ботки ими мазков;

- люминесцентный микроскоп с источником питания. До начала работы люминесцирующие иммуноглобулины и контрастирующий альбумин растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы (обычно в 0,5 мл). К использованию пригодны лишь те конъюгаты, ко­торые легко и без осадка растворяются в течение 1-2 мин. Растворенные конъюгаты можно хранить при 2-4⁰С в те­чение нескольких недель плотно закрытыми.

Окраску мазков производят так называемой рабочей смесью конъюгатов, которую также готовят заблаговремен­но, но срок ее хранения при 2-4⁰С не должен превышать семи дней.

Важнейшим условием правильного составления рабочей смеси конъюгатов является оптимальный подбор в ней со­отношения люминесцирующего иммуноглобулина, меченного ФИТЦ, и альбумина, меченного производными родамина. Это достигается титрованием люминесцирующих конъюгатов на контрольных мазках, содержащих гомологичные люми­несцирующим иммуноглобулином микроорганизмы или их антигены (диагностикумы и т. п.).

Прежде всего, определяют красящий титр контрастирую­щего альбумина (табл. 1). Для этого из исходного раствора люминесцирующего альбумина готовят ряд двукратных разведений на забуференном изотоническом растворе. Затем полученные разведения наносят на мазки и инкубируют стекла с мазками во влажной камере при температуре 37⁰С в течение 30 мин. Далее мазки дважды (каждый раз по 5 мин) отмывают забуференным изотоническим раствором и ополаскивают дистиллированной водой. После высушивания на воздухе мазки подвергают люминесцентной микроскопии.

Таблица 1