Лучевые реакции молекул

Лекция 3. Радиационно-биохимические процессы в клетках

1. Лучевые реакции молекул. Реакция клеток на облучение

2. Кривые доза-эффект и их интерпретация. Радиочувствительность клетки на разных стадиях жизненного цикла

3. Модификация радиочувствительности. Кислородный эффект. Пострадиационное восстановление клеток

4. Системный ответ клетки на лучевое повреждение

В механизме формирования биологического ответа на действие ионизирующих излучений на живые объекты условно можно выделить следующие этапы:

§ первичные физические явления - поглощение энергии излучения атомами и молекулами биологического объекта, в результате чего они могут претерпевать возбуждение, ионизацию или диссоциацию;

§ радиационно-химические процессы, при которых образуются свободные радикалы, взаимодействующие с органическими и неорганическими веществами по типу окислительно-восстановительных реакций;

§ биологические реакции - обусловливают изменения функций и структур органов и систем и реакций целостного организма. Они определяют в конечном итоге механизм развития и специфику патологического процесса.

Энергия ионизирующих излучений при прохождении через биологическую ткань передается атомам и молекулам, что приводит к образованию ионов и возбужденных молекул. Это первый, физический этап формирования биологического ответа клетки на лучевое воздействие. Следующий этап называется химическим.

В основе первичных радиационно-химических изменений молекул могут лежать два механизма: 1) прямое действие, когда данная молекула испытывает изменения (ионизацию, возбуждение) непосредственно при взаимодействии с излучением; 2) косвенное действие, когда молекула непосредственно не поглощает энергию ионизирующего излучения, а получает ее путем передачи от другой молекулы, радикала или иона.

Поскольку 60 - 70 % массы биологической ткани составляет вода, рассмотрим различие между прямым и косвенным действием излучения на ее примере.

Начальные процессы радиолиза, приводящие к образованию радикалов Н* и ОН*, представлены на схеме:

Н₂О → Н₂О⁺+ е^-

Н₂О⁺ → Н⁺ + ОН^·

e^- → е_aq^-

Ионизированная молекула воды реагирует с другой нейтральной молекулой воды, в результате чего образуется высокореактивный радикал гидроксила ОН^·:

Н₂О⁺ + Н₂О ® Н₃О⁺ + ОН^·.

Вырванный электрон также очень быстро передает энергию окружающим молекулам воды, в результате чего возникает сильно возбужденная молекула воды Н₂О^*, которая диссоциирует с образованием двух радикалов Н^· и ОН^·:

Н₂О⁺ + е^- ® Н₂О* ® Н^· + ОН^·.

Свободные радикалы содержат неспаренные электроны и отличаются чрезвычайно высокой реакционной способностью. Время их жизни в воде не более 10^-5с. За это время они либо рекомбинируют друг с другом, либо реагируют с субстратом.

e^- + e_aq^-→ H₂ + 2OH^-

H^•+H^•→H₂

OH^•+OH•→H₂O₂

В присутствии растворенного в воде кислорода образуются и другие продукты радиолиза: свободный радикал гидроперекиси НО₂^·, перекись водорода Н₂О₂, атомарный кислород и радикал кислорода О₂^-•, который называется супероксидным радикалом:

Н^· + О₂ ® НО₂^·;

НО₂^· + НО₂^· ® Н₂О₂ + 2О;

e_aq^- + О2 → О₂^-•;

ОН^- + НО₂^· → Н2О + О₂^-•.

Супероксидный и гидропероксидный радикалы могут наносить очень серьезные повреждения биологически важным молекулам.

При облучении водных растворов ионизирующими излучениями с малыми величинами линейной передачи энергии (ЛПЭ)[1], радикалы - продукты радиолиза воды - возникают на значительных расстояниях друг от друга, в силу чего возрастает вероятность их взаимодействия с молекулами растворенных биологически важных веществ. Если излучение характеризуется высокими значениями ЛПЭ, то в плотном треке происходят радикал-радикальные взаимодействия, в силу чего снижается вероятность радиационно-химических превращений растворенных в воде веществ.

В клетке организма ситуация значительно более сложная, чем при облучении воды, особенно если поглощающим веществом являются крупные и многокомпонентные биологические молекулы. В этом случае образуются органические радикалы D^·, отличающиеся также крайне высокой реакционной способностью. Располагая большим количеством энергии, они легко могут привести к разрыву химических связей. Именно этот процесс и происходит чаще всего в промежутках между образованием ионных пар и формированием конечных химических продуктов. Кроме того, биологическое действие усиливается за счет кислородного эффекта. Образующийся в результате взаимодействия свободного радикала с кислородом также высокореакционный продукт DО₂^· (D^· + О₂ ® DО₂^·) приводит к образованию новых молекул в облучаемой системе. Получающиеся в процессе радиолиза воды свободные радикалы и окислители, обладая высокой химической активностью, вступают в химические реакции с молекулами белка, ферментов и других структурных элементов биологической ткани, что приводит к изменению биологических процессов в организме. В результате нарушаются обменные процессы, подавляется активность ферментных систем, замедляется и прекращается рост тканей, возникают новые химические соединения, не свойственные организму, - токсины. Это приводит к нарушению жизнедеятельности отдельных систем или организма в целом.

Первым этапом радиационно-химических превращений биологических макромолекул под действием продуктов радиолиза воды является образование радикалов. Здесь можно отметить три основных типа реакций:

§ отщепление атома водорода с разрывом связи -С-Н: RH + OH = R^· + H₂O.

§ разрыв двойной межуглеродной связи: R₁H₂C=CH₂R₂ + OH = R₁H₂C^·-CH₂R₂-OH

§ отщепление присоединенной группы: NH₂-CR + H = -C^·R + NH_3.

Следующим этапом являются межрадикальные реакции и реакции радикалов с другими молекулами:

§ гидроксилирование или гидрирование: R^· +OH (H) = ROH(H) и в дальнейшем образование карбонильных соединений RC=O.

§ димеризация: R^· + R^· = R-R.

§ диспропорционирование: R^· + R^· = RH + RC=CR.

§ гидроперекисные превращения: R^· + O2 = ROO^· + RH = R^· +ROOH Þ альдегиды, кетоны, спирты.

Индуцированные свободными радикалами химические реакции вовлекают в этот процесс многие сотни и тысячи молекул, не затронутых излучением. В этом состоит специфика действия ионизирующего излучения на биологические объекты. Никакой другой вид энергии (тепловой, электрической и др.), поглощенной биологическим объектом в том же количестве, не приводит к таким изменениям, какие вызывают ионизирующее излучение.

Различить относительную долю прямого и косвенного излучения можно единственно с использованием так называемого эффекта разведения, который можно наблюдать при облучении растворов различных концентраций. Г. Фрикке и У.М. Дейлом в 30-40-х годах на водных растворах ферментов было установлено, что в слабых растворах действие излучения преимущественно косвенное, так как большая часть молекул растворенного вещества не участвует в реакции, протекание которой является следствием ионизации молекул растворителя. При этом число инактивированных молекул не зависит от их концентрации, так как для данной дозы в растворе образуется постоянное количество способных прореагировать водных радикалов. Иными словами, при косвенном действии независимо от разведения раствора постоянным остается абсолютное число поврежденных молекул, а изменяется их отношение к числу неповрежденных. При прямом действии число инактивированных молекул увеличивается с возрастанием концентрации раствора, а их отношение к числу неповрежденных молекул остается постоянным.

Рассмотрим лучевые реакции основных биологических макромолекул.

Фосфолипиды формируют клеточные мембраны. Они могут служить мишенью, так как повреждение их даже в небольших количествах может изменить проницаемость мембран и нарушить обменные процессы в клетке. В состав фосфолипидов входят две жирные кислоты, одна из которых, как правило, насыщенная, а другая – ненасыщенная. Они составляют гидрофобный «хвост» фосфолипида. В состав гидрофильной головки входят фосфат-ион и положительно заряженная группа. Радиационно-химические превращения фосфолипидовначинаются с разрушения двойной связи в ненасыщенной жирной кислоте. В присутствии кислорода за этим следует образование гидроперекиси и распад последней с образованием различных карбонильных соединений и гидроперекисей. Еще одним превращением фосфолипидов является отщепление неорганического фосфата.

Среди нуклеиновых кислот наиболее вероятной внутриклеточной мишенью является ДНК - самая большая по размеру и наиболее биологически значимая молекула. Мономерные составляющие нуклеиновых кислот - нуклеотиды – включают в себя три компонента: азотистое основание (пурин или пиримидин), пентозу (рибозу или дезоксирибозу) и фосфат-ион. При радиолизе нуклеиновых кислот обнаружены изменения в азотистых основаниях, отмечены разрывы гликозидной связи углевод-основание и фосфоэфирной связи углевод-фосфат. Кроме того, происходят одиночные и двойные разрывы тяжей ДНК, разрывы водородных связей между комплементарными основаниями в двойной спирали, ковалентные сшивки. Двойные разрывы тяжей ДНК являются критической реакцией для репродуктивной гибели клеток.

РНК, представленную в клетке рядом форм – матричной, рибосомальной, транспортной, относят к массовым структурам клетки: они повторяются, содержась во многих копиях, и в случае необходимости могут синтезироваться в требуемом количестве. Поэтому радиационное повреждение РНК не столь ответственно за лучевое поражение клетки, как повреждение молекул ДНК. В основном типы радиационных повреждений РНК сходны с таковыми для ДНК.

Радиолиз углеводов начинается с отщепления водорода от одного из углеродных атомов с образованием углеводного радикала. После этого отщепление молекулы воды и присоединение к радикалу Н или ОН приводит к образованию карбонильного соединения.

Радиочувствительность белков во многом определяется радиочувствительностью входящих в их состав аминокислот. Ряд радиочувствительности аминокислот по мере ее снижения выглядит так: серосодержащие (цистеин, метионин); некоторые циклические (тирозин, триптофан, гистидин); имеющие в остатке азотсодержащие группы (аргинин, аспарагин, глутамин); аминокислоты, не содержащие в остатке присоединенных групп, или содержащие -ОН (фенилаланин, пролин, валин, лейцин, изолейцин, глицин, серин, треонин). Данные по радиочувствительности аминокислот нельзя безоговорочно переносить на белки - их поражаемость зависит от расположения остатков аминокислот, структуры белковой молекулы.

При действии ионизирующих излучений на белковые молекулы индуцируются изменения в аминокислотных остатках, обпазующих макромолекулу. Эти изменения начинаются возникновением продуктов отщепления карбоксильных групп с разрывом связи С-С, аминогрупп с разрывом связи С-N. Существенные изменения возникают в структуре остатков серусодержащих аминокислот.

В водных средах существенную роль в радиационно-химических превращениях белковых молекул играют продукты радиолиза воды – радикал ОН^· и гидратированный электрон . В результате первичного размена энергии в молекуле белка возникаю свободнорадикальные формы, которые принимают участие в дальнейших реакциях.

Так как возникшие возбужденные электроны могут свободно мигрировать вдоль полипептидной цепи, в кончном итоге свободнорадикальные состояния локализуются в определенных местах белковой молекулы. Через промежуточные соединения, образующиеся по центрам локализации свободнорадикальных состояний, белки расщепляются и образуются фрагменты белковых молекул. Вместе с тем, свободные радикалы могут инициировать процессы полимеризации в разных участках белковой молекулы, образовывать амиды и карбонильные соединения; нарушения водородных связей может сопровождаться денатурацией белков. Неодинаковость радиационного повреждения различных аминокислотных остатков в молекуле белка является причиной нарушения вторичной и третичной структур белка. Кроме того, может нарушаться функционирование активных центров ферментов или же центров аллостерического взаимодействия.

С утратой свойственных неповрежденным белкам конформационных состояний связано ослабление способности белка к молекулярному узнаванию, определяющему самосборку надмолекулярных структур, таких, как мультиэнзимные комплексы, хроматин, цитоскелет, электрон-транспортная цепь митохондрий (хлоропластов).

Учитывая множественность молекул отдельных белков, возможность их синтеза de novo в случае дефицита, при умеренных облучениях прямое повреждение белковых молекул не имеет решающего значения для жизнеспособности клеток.

Основной количественной характеристикой радиационно-химических процессов является величина выхода продуктов реакции. Радиационно-химический выход измеряется числом превратившихся в ходе радиационно-химической реакции молекул на 100 эВ поглощенной энергии излучения. Суммарный выход радиационно-химических превращений воды составляет около 4. Полное описание радиационно-химических процессов в клетке представляет собой сложную задачу и обычно ограничивается упрощенным подходом, обращая внимание на значение повреждений молекул, выполняющих наиболее важные в жизнедеятельности функции.