Методы определения микотоксинов

Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные аналитические и биологические методы.

Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К числу скрининг-методов относятся методы тонкослойной хроматографии (ТСХ-методы), флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. В настоящее время наиболее распространенными являются химические методы, включающие две стадии: стадию выделения и стадию количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение и количественное определение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов. Универсальным методом определения всех видов микотоксинов является тонкослойная хроматография (ТСХ).

При отборе проб из партии продукта основной задачей является получение среднего образца или средней пробы, по концентрации микотоксинов являющейся представительной для всей партии (отобранные образцы должны характеризовать качество всей партии). Выполнение этой задачи зависит от природы и распределения микотоксинов, характеристики продукта (сырой, обработанный, сыпучий, жидкий, пастообразный и т. д.), способа подготовки образца. Например, загрязнение арахиса афлатоксинами имеет выраженный гетерогенный характер: в отдельных зернах арахиса их содержание может колебаться от тысячных долей миллиграмма до десятков и более миллиграммов на 1 кг, т. е. различаться на 5-6 порядков. По этой причине вклад ошибки при отборе пробы в общую ошибку анализа при определении афлатоксинов в арахисе является основным и в ряде случаев может составлять более 90 %.

С точки зрения однородности загрязнения микотоксинами все продукты можно разделить на две группы: 1) продукты с высокой степенью неоднородности (очищенный и неочищенный арахис, масличные семена, целые или грубомолотые зерна, орехи); 2) продукты с однородным характером загрязнения (жидкости: молоко, растительные масла, соки, пюре; мука, размолотые шроты).

Для получения представительного среднего образца продуктов l-й группы размер исходного образца должен быть максимально возможным (не менее 2 кг), при этом средний лабораторный образец следует выделять из перемолотого (гомогенизированного) среднего образца.

Для однородных продуктов 2-й группы (джем, повидло, фруктовые соки в мелкой жестяной таре, сгущенное молоко, сухие молочные продукты и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих величине среднего образца (100-200 г), при условии, что продукт происходит из одной партии.

Химические методы обнаружения и идентификации отдельных афлатоксинов основаны на их специфической флуоресценции в УФ-свете (около 365 нм), на различиях в подвижности при тонкослойной хроматографии, на специфичности их спектров поглощения и флуоресценции.

В отличие от афлатоксинов трихотецены не обладают поглощением или, флуоресценцией в видимой части спектра, что затрудняет их обнаружение при тонкослойной хроматографии. Однако выявить трихотецены с помощью ТСХ возможно при использовании методов, основанных на обработке ТСХ-пластин специальными реагентами, которые образуют с трихотеценами окрашенные или флуоресцирующие производные. Например, Т -2 токсин при обработке пластин; концентрированной серной кислотой образует пятна с голубой флуоресценцией;) в УФ-свете.

Арбитражными методами количественного определения микотоксинов являются следующие:

• газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина);

• высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использованием УФ-фотометрического детектора (для дезоксиниваленола и патулина);

• ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксинов; и зеараленона).

На рис. 2 представлено устройство современного жидкостного хроматографа в простейшем исполнении.

Подвижная фаза из емкости 1 через входной фильтр 9 подается насосом высокого давления 2 в систему ввода образца 3 - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее через фильтр 8 образец с током подвижной фазы поступает через предколонку в разделительную колонку 4. Затем поток подвижной фазы, выходящий из колонки и содержащий компоненты разделяемой смеси (элюат), поступает в детектор 5 и удаляется в сливную емкость 7. При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор 6 или в компьютер.

Рис. 2

Устройство жидкостного хроматографа (изократическая система):

1 - емкость; 2 - система высокого давления; 3 - ручной инжектор или автосамплер; 4 - разделительная колонка; 5 - детектор; б - регистратор или компьютер; 7 - сливная емкость; 8 - фильтр; 9 - входной фильтр

Система, приведенная на рис. 2, является изократической: в процессе хроматографирования состав подвижной фазы не изменяется. Если в ходе хроматогфического анализа необходимо изменять концентрацию одного или нескольких компонентов подвижной фазы, то применяют так называемые градиентные системы, состоящие обычно из двух или более насосов. В случае градиентного элюирования каждый растворитель подается из отдельного сосуда в специальную смесительную камеру с магнитной мешалкой, где по определенной программе происходит их смешивание с заданным соотношением объемов.

Для анализа микотоксинов чаще применяются градиентные системы, где в качестве подвижной фазы используются растворы ацетонитрила в воде с линейно изменяющейся во времени концентрацией.

Хроматографическая колонка представляет собой металлическую трубку ой от 150 до 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную специальным сорбентом на основе силикагеля с привитыми углеводородными радикалами. Предколонка служит для защиты хроматографической колонки от загрязнений.

УФ-фотометрический детектор является наиболее распространенным видом детекторов для ВЭЖХ. Принцип действия детектора аналогичен принципу действия обычного спектрофотометра: он регистрирует оптическую плотность раствора. Различие состоит в том, что УФ-детектор является проточным, вместо кюветы с раствором в нем используется фотометрическая ячейка. Поток элюента протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником света служит ртутная лампа, дающая интенсивное УФ-излучение. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров, проходит через ячейки, частично поглощается молекулами подвижной фазы и разделяемых компонентов и улавливается фотоприемником. Светопоглощение (оптическую плотность) элюата непрерывно регистрирует самописец или компьютер, записывая хроматограмму. Разделяемые компоненты смеси (например, микотоксины) представлены на хроматограмме в виде пиков. Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, а площадь пика - для количественного определения.

Более сложное устройство представляет собой флуоресцентный (флуориметрический) детектор. Такой детектор использует способность органических соединений, в частности афлатоксинов и зеараленона, флуоресцировать под действием УФ- или видимого излучения. Флуоресцентный детектор имеет проточную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции. В случае анализа афлатоксинов B₁ и М₁ длина волны возбуждающего излучения составляет 360 нм, а длина волны испускаемого излучения - 420 нм.

Следует отметить, что для анализа афлатоксинов можно применять также УФ-детектор, однако его чувствительность на порядок ниже, чем у флуориметрического детектора, поэтому при анализе низких концентраций афлатоксинов (на уровне ПДК и ниже) предпочтительным является флуоресцентное детектирование.