Определение бактериальных эндотоксинов

Для определения пирогенности воды и растворов для инъекций применяют тест на определение эндотоксинов (лимулус-тест или лал-тест). В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами (липосахаридами) грамотрицательных бактерий. В результате реакции между эндотоксином и лизатом происходит помутнение прозрачной смеси или образование твердого геля, что и служит подтверждением присутствия эндотоксина. Реакция проходит за 30-60 мин. Чувствительность реакции во много раз превышает чувствительность фармакопейного теста на кроликах. Сырьем для получения лал-реагента служит кровь мечехвостов – морских животных, обитающих у берегов Северной Америки, Японии, Китая, Вьетнама, Индии. Лал-реактив получают по следующей схеме: сбор крови в раствор антикоагулянта ® отделение амебоцитов от плазмы центрифугированием ® отмывание амебоцитов ® лизирование амебоцитов ® очистка лизата ® повышение чувствительности лизата ® сублимационная сушка. Перед использованием сублимационно высушенный лизат растворяют в апирогенной воде.

Реакция лизата амебоцитов с эндотоксинами была открыта в США в 1964 г. Первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus Polyphemus. Лизат, полученный из их крови Limulus Amebocyte Lisate – сокращенно – ЛАЛ-реактив, а сама реакция – ЛАЛ-тест.

Промышленный выпуск ЛАЛ-реактива начался в США в конце 70-х годов XX столетия. В настоящее время в США 10 фирм-производителей выпускают реактив, кроме того, есть производители в Китае и Японии. Выпускаемые препараты отличаются чувствительностью (самый высокочувствительный способен определять 0,01 э.ед./л.), назначением (для определения в фармацевтических препаратах, крови, фильтрах и др.), методикой выполнения анализа (гель-тромб тест, турбидиметрический метод). Срок годности ЛАЛ-реактивов составляет от 2 до 5 лет.

Впервые официально ЛАЛ-тест признан в 1980 г в США. В Федеральном регистре было опубликовано руководство по его применению для контроля медицинских и ветеринарных препаратов. В 1980 г ЛАЛ-тест был включен в XX издание фармакопеи США.

Применение ЛАЛ-теста в медицине и фармации имеет несколько направлений:

1. Применение в клинической практике для диагностики заболеваний, вызванных грамотрицательными микроорганизмами.

2. Применение в фармации для постадийного контроля и оценки качества готового продукта.

Так как приготовление инъекционных средств должно проводиться максимально быстро, ЛАЛ-тест сегодня – единственный реактив, который может быть использован для постадийного контроля растворов для инъекций на апирогенность. Наиболее рациональными точками контроля являются исходное сырье, вода для инъекций, фильтры, растворы перед стерилизующим фильтрованием, ампулы и флаконы. Следует отметить также эффективность ЛАЛ-реактивов для установления режимов работы технологического оборудования – мойки ампул, флаконов, термической депирогенизации и др.

Применение ЛАЛ-теста для постадийного контроля инъекционных растворов позволяет повысить их качество и снизить стоимость затрат. Применение ЛАЛ-теста позволило фирме «Берингер Мангейм» (Германия) сэкономить 1100 кроликов, ликвидировать 280 мест их содержания, в 2 раза уменьшить затраты на питание. На фирме «Хаус Хекст» (Германия) экономия составила 500 мест и 1000 животных.

Лал-тест используется прежде всего для определения содержания эндотоксинов в радиофармацевтических средствах, в тех средствах, которые невозможно оценить на кроликах – седативных, наркотических, а также в лекарственных средствах, не вводимых внутривенно.

В большинстве случаев ЛАЛ-тест, даже если он и включен в Фармакопею, не заменяет тест на кроликах, а является самостоятельным. Это связано с тем, что не всегда прослеживается четкая корреляция между ЛАЛ-тестом и определением апирогенности на кроликах. Определенно установлено следующее: содержание эндотоксина < 5 э.ед./л дает у кроликов отрицательную реакцию на пирогенность, а > 50 э.ед./л – положительную.

Определение бактериальных эндотоксинов в инъекционных лекарственных средствах проводят в соответствии требованиями ГФ РБ (ГФ РБ, Т. I, Ст. 2.6.14).

РАСТВОРИТЕЛИ ДЛЯ ИНЪЕКЦИОННЫХ РАСТВОРОВ

Вода для инъекций - Аqua pro inectionibus, ГФ РБ. Вода для инъекций должна отвечать требованиям, предъявляемым к воде очищенной и, кроме того, быть апирогенной.

Пирогенные вещества нелетучи и не перегоняются с водяным паром. Однако при интенсивном кипении пар может захватывать капельки жидкости с растворенным в ней пирогенными веществами. Во избежание попадания капель воды в дистиллят в современных аквадистилляторах предусмотрены специальные брызгоулавливающие устройства - сепараторы. Сепараторы бывают центробежные, пленочные, объемные, комбинированные. В центробежных аппаратах создается вращательное движение сепарируемого пара. Под действием ускорения частицы влаги выделяются из потока пара. Пленочные сепараторы состоят из набора пластинок различного профиля, через зазоры которых проходит пар. В объемных сепараторах капли воды выпадают из потока пара под действием сил тяжести. В комбинированных сепараторах используется соединение нескольких видов сепарации.

Используют аппараты АА-1, А-10, АЭВС- 60. Основные части аппаратов: камера испарения с нагревающим устройством, сепаратор, конденсатор, сборник. Для химической обработки воды с целью окисления органических и пирогенных веществ и связывания аммиака имеется дозирующее устройство для подачи растворов калия перманганата и алюмокалиевых квасцов с гидрофосфатом натрия. На 1 л кипящей воды добавляют 0,152 г калия перманганата, 0,228 г алюмокалиевых квасцов и 0,228 г натрия фосфата двузамещенного.

Получение воды для инъекций производится в асептических условиях в помещении водоподготовки. Категорически запрещается выполнять какие-либо работы, не связанные с перегонкой воды. В аптеке назначается лицо, ответственное за сбор и за хранение воды очищенной и воды для инъекций. Полученная вода для инъекций собирается в обработанные паром сборники, чаще всего в стеклянные баллоны. Если сборников несколько, они нумеруются. Сборники снабжаются пробкой с трубкой, в которую помещают стерильную вату. Вату меняют ежедневно. Вода для инъекций может подаваться на рабочее место фармацевта с помощью трубопровода.

Вода для инъекций должна использоваться свежеприготовленная. Хранится в аптеке при температуре от 5 до 25°С. Срок хранения 24 часа.

Для приготовления глазных капель и примочек, растворов для новорожденных детей, отдельных растворов для наружного прим используется вода очищенная.