№ п/п | С,% | , % | Ес, % | ||
1. 2. 3. 4. 5. | |||||
Сред. |
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 25
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ БЕЛКА
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: исследование поглощения света различными веществами.
ПРИБОРЫ И ПРИНАДЛЕЖНОСТИ: спектрофотометр СФ-26 (или аналогичный спектрофотометр), раствор сыворочного альбумина (яичного альбумина или пенсина) в воде.
V. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
Поглощение (абсорбцией) света называется явление уменьшения энергии световой волны при ее распространении в веществе вследствие преобразования энергии волны в теплоту и другие виды энергии. Это происходит одновременно с рассеянием света. Рассеяние света происходит в средах при условии, что размеры неоднородностей соизмеримы с длиной волны света. При рассеянии света энергия сохраняет свою электромагнитную природу.
Поглощение света в веществе описывается законом Бугера:
, (1)
где J0 и J – интенсивности плоской монохроматической световой волны на входе и выходе слоя вещества толщиной d; a - коэффициент поглощения зависящий от длины волны l света, химической природы и состояния вещества и не зависящий от интенсивности света. При интенсивность света J по сравнению с J0 уменьшается в «е» раз (т.е.» 2,72 приблизительно в три раза).
|
|
Показатель поглощения характеризуется поглощательную способность вещества.
Постепенное убывание интенсивности света при прохождении через среду вследствие рассеяния также подчиняется закону Бугера, формула (1) которого с учетом поглощения и рассеяния принимает вид:
, (2)
где - s - показатель ослабления света вследствие рассеяния.
Исследования поглощения монохроматического света растворами окрашенных веществ (при условии, что расворитель не поглощает света данной длины волны и раствор имеет невысокую концентрацию). Бер показал, что оно также подчиняется закону Бугера.
Закон Бера гласит:
«показатель поглощения a прямо пропорционален концентрации вещества в растворе:
, (3)
где х – показатель поглощения для раствора единичной концентрации». Для разных веществ зная (3) и (1) имеем:
- закон Бугера-Бера (4)
или в системе десятичных логарифмов
, где .
Отношение - называют коэффициентом пропускания или прозрачностью, а величину - оптической плотностью. Учитывая выше приведенную формулу оптическая плотность раствора
D = xcd (5)
где D – оптическая плотность,
с – концентрация вещества,
х – коэффициент экстинкции х = 0,434х’.
На практике закон Бугера-Бера выполняется в некоторых пределах, концентрации (до значения оптической плотности D=0,3 до D=1,5. Эти условия подбирают, изменяя концентрацию или длину оптического пути (толщину кюветы).
|
|
Оптическая плотность раствора зависит от длины волны измеряемого света и не зависит от его интенсивности. Кривая выражающая эту зависимость называется спектром поглощения.
II. Описание экспериментальной установки (СФ-26)
Спектрофотометр предназначен для измерения коэффициента пропускания жидких и твердых веществ в области спектра от 186 до 110 Нм.
Спектрофотометр состоит из монопроматора с измерительным прибором 2, кюветного отделения 3, камеры 4 с фотоприемниками и усилителем и осветителя 5 с источниками излучения и стабилизатором.
Основной частью монохоматора является призма которая поворачивает при вращении рукоятки 6 одновременно происходит перемещение школы 7 длин волн. Раскрытие входной и выходной щелей осуществляется с помощью рукоятки 8. Щели открываются в пределах от 0,01 до 2 мм.
В спектрофотометре используются два источника сплошного спектра: дейтериевая лампа для работы в области спектра от 186 до 350 нм и лампа накаливания для работы в области спектра от 340 до 1100 нм. Смена источников излучения производится в диапазоне от 340 до 350 нм путем переключения зеркального конденсатора рукояткой 9.
Кюветное отделение 3 предназначено для установки измеряемых и контрольных образцов (образцов сравнения). Для крепления плоских твердых образцов в кюветном отделении служит держатель с четырьмя окнами и пружинами, позволяющий устанавливать и измерять пропускание образцов толщиной от 0,5 до 2 мм, шириной от 8 до 15 мм.
Для исследования жидкостей используются прямоугольные кюветы из кварцевого стекла для слоя жидкости толщиной 10 мм. Кюветы помещаются в держатель с четырьмя гнездами. Держатели твердых образцов и прямоугольных кювет устанавливаются в каретку стороной с белой точкой к оператору, предельно близко к выходному окну монохрометра. Каретка с образцами перемещается с помощью рукоятки 10 и может фиксироваться в четырех положения: «1», «2», «3», и «4», соответствующих четырем кюветам.
Измерение коэффициентов пропускания образцов производится при плотно закрытой крышке кюветного отделения.
Переключение элементов производится с помощью рукоятки 11. если рукоятка находится в положении «Ф», в схему включен сурьмяно-цезиевой фотоэлемент, и в положении «К» в схему включен кислородно-цизиевой фотоэлемент.
В камере 4 находится осушительный патрон с силикагелем. Шкалы измерительного прибора 2, оцифрованные в процентах пропускания Т и единицах оптической плотности Д.
На основании расположены сигнальная лампа 12 и тумблер сеть: сигнальная лампа 13 (Д), показывающая включение дейнгерневой лампы; сигнальная лампа 14 (Н), показывающая включение лампы накаливания, рукоятка 15 включения регистров компенсации при растяжке 10-процентного диапазона на всю шкалу, имеющая 10 положений, обеспечивающих работу в диапазонах коэффициентов пропускания от 110 до 100, 100-90…. от 10-0; рукоятка 16 отсчет для выбора шкалы измерений, имеющая четыре положения. Положение «х1» рукоятки «отсчет» используется для измерения в диапазоне от 100 до 0; положение «х0,1» используется для растяжки 10-процентного диапазона на всю шкалу измерительного прибора при включенном компенсаторе; положение калибр используется для установки 100-процентного отсчета при работе с сильно поглощающими образцами. В этом случае измерения проводят с более широкими щелями для усиления светового потока, положение «х0,01» используется для измерения образцов с пропусканием меньше 10% для растяжки одного процента из диапазона от 0 до 10% в 100 раз на всю шкалу измерительного прибора (растяжка одного процента из диапазона от 2 до 10% производится при включенном компенсаторе).
На передней стенке камеры 4 расположена рукоятка 17 шторки, рукоятка 18 установки нуля, рукоятка 19 установки чувствительности.
|
|
Установка нуля осуществляется потенциометром с двойной регулировкой (грубой и тонкой), поэтому необходимо пользоваться им с большой осторожностью, не прилагая усилий.
Панель стабилизатора показана на рис. 2.
Ось 1 резистора для регулировки разрядного тока, ось 2 резистора для регулировки рабочего тока накала дейтериевой лампы, тумблер 3 и клеммы 4 для включения амперметра в цепь стабилизатора при установке разрядного тока и для включения амперметра в цепь накала дейтериевой лампы при установке рабочего тока накала лампы, предохранитель 5, клемма 6 для заземления и сетевая розетка 7.
III. Порядок выполнения работы
1. Приготовьте раствор сыворочного альбумина (яичного альбумина или пепсина) в воде, имеющий концентрацию 5 мг/мл.
2. Измерить оптическую плотность раствора при 280 ммк в кварцевых прямоугольных кюветах, которая должна быть равна ~ 0,5. При разведении раствора пользоваться формулой D = с e l.
3. Установите в рабочее положение фотоэлемент и источник излучения, соответствующие выбранному спектральному диапазону измерений.
4. Закройте фотоэлемент, поставив рукоятку 17 шторки в положение ЗАКР., и рукояткой 8 установите ширину щели примерно 0,1 мм..
5. Включите тумблер СЕТЬ, должна загореться сигнальная лампа СЕТЬ и сигнальная лампа D или сигнальная лампа Н в соответствии с выбранным источником (стабильная работа СФ-26) или другого спектрофотометра после включения в течение 1 часа).
6. Для включения после лампы накаливания дейтериевой лампы переключите конденсор рукояткой 9; после минутного прогрева лампа автоматически загорается, одновременно загорается и соответствующая индикаторная лампа.
7. Установите требуемую длину волны, вращая рукоятку 6 в сторону увеличения длин волн. Если при этом шкала повернется на большую величину, то возвратите ее назад на 3-5 нм и снова подведите к требуемому делению.
8. Поставьте рукоятку 19 в положение «1» (рабочее положение). Если поток излучения недостаточен измеряемый и контрольный образцы значительно поглощают излучение, установите рукоятку в положение «2», «3» или «4». При работе в положении КАЛИБР или «х0,01» рукоятку 16 рукоятку 19 установите также в одно положение «2», «3», «4».
|
|
9. Установите на пути потока излучения контрольный образец, перемещая каретку 10.
10. При отсутствии образца сравнения величина потока, проходящего через свободное окно держатся фильтров, принимается за 100% пропускания.
11. Установите стрелку измерительного прибора на нуль рукояткой 18 НУЛЬ.
12. Откройте фотоэлемент, поставив рукоятку 17 шторки в положение ОТКР.
13. Установите стрелку измерительного прибора на деление «100%», вращая рукоятку 8 механизма изменения ширины щели.
14. Установите в рабочее положение измеряемой образец, перемещая каретку рукояткой 10, и снимите отсчет по шкале оптической плотности D через каждые 5 нм в интервале 220-320 нм.
15. Выведите из потока излучения измеряемый образец и введите контрольный образец при этом стрелка измерительного прибора должна вернуться к делению «100%».
16. Данные эксперимента занесите в таблицу 1.
17. Постройте кривую спектра поглощения, откладывая по оси абсцисс длину волны, а по оси ординат оптическую плотность раствора сывороточного альбумина.
Таблица 1