Морфология и ультраструктура вирусов

Цель занятия: освоить бактериоскопический метод выявления вирусов в материалах и изучить особенности морфологии и ультраструктуры вирусов с использованием метода электронной микроскопии.

Материалы и оборудование: 1) электронные микрофотографии и демонстрационные рисунки: а) простых и сложных вирусов, б) вирусов с разными типами симметрии, в) вирусов с оболочками разной архитектуры; 2) световой микроскоп; 3) флюоресцентный микроскоп; 4) музейные препараты с вирусными включениями в клетках пораженных тканей растений и животных; 5) препарат или фотография флюоресцентной микроскопии препарата вирусоинфицированных клеток.

Задание 1: проведите вирусоскопическое исследование демонст-рационных препаратов клеток, пораженных вирусами.

Ход работы

1 Прочтите приведенное ниже краткое описание микроскопических методов, используемых для выявления вирусов в материалах (вирусоскопия в иммерсионном и люминес­центном микроскопах).

Вирусоскопия. В иммерсионном световом микроскопе об­наруживаются самые крупные элементарные тельца. Так, при натуральной оспе в жидкости кожных пузырьков находят вирионы Пашена, а в таких же везикулах при ветряной оспе – вирионы Арагана.

Легче при вирусных инфекциях выявить внутриклеточные включения (рисунок 8).

Рисунок 8 –Вирусные включения:

1 – тельца Гуарниери в клетке, зараженной вирусом оспы; 2 – включения в цилиндриче­ском эпителии, зараженном вирусом гриппа; 3 – включения в эпителии, зараженном реовирусом; 4 – тельца Бабеша-Негри в нейроцитах; 5,6 – внутриядерные включения в эпителии, зараженном герпес- и аденовирусом; 7 – внут­риядерные и цитоплазматические включения в эпителии, зараженном вирусом кори

В основном они представлены скоплениями вирионов вперемешку с реактивными клеточными продуктами и в за­висимости от места репликации вирионов находятся в цито­плазме или ядре клеток-хозяев. В частности, цитоплазматическими включениями являются тельца Гуарниери в эпителиаль­ных клетках, скопления реовирусов и вирусов гриппа в них, тельца Бабеша-Негри – в нейроцитах. Ядерные адено-, папова- и герпесвирусные включения состоят из клеточного материала. Изредка в одной и той же клетке вирусы, например, ко­ревой, формируют цитоплазматические и ядерные включения.

По форме, размерам, структуре, отношению к кра­сителям вирусные вклю­чения строго специфичны. Например, тельца Гуарние­ри имеют округлую, серпо­видную или амебоидную форму диаметром 1–10 мкм, тельца Бабеша-Негри – овальные или эллипсоид­ные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов сер­повидные, наполовину охва­тывающие клеточное ядро, коревые включения – в виде почкующихся мелких дрож­жей (рисунок 9).

В препаратах, обработанных мечеными антителами под люминесцентным микро­скопом обнаруживают вне- и внутриклеточно расположенные вирионы в виде разноцветных точек и конгломератов в зависи­мости от природы используемого флюорохрома (рисунок 10).

Рисунок 9 – Тельца Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга

На сегодняшний день в ветеринарии применяется единственный информативный и достаточно точный метод диагностики бешенства у животных. Это посмертное исследование срезов аммоновых рогов головного мозга и обнаружение в них специфических включений – телец Бабеша - Негри. Состоят тельца Бабеша - Негри из тонковолокнистого матрикса и вирусного рибонуклеопротеида.

Рисунок 10 ― Вирус гриппа в культуре клеток через 12 ч после инфи­цирования (иммунофлюоресцентная микроскопия, ˟ 1200). Видны светящиеся комплексы в ядре и на внутренней поверхности плазмалеммы

2 Используя флюоресцентный микроскоп, рассмотрите препарат культуры клеток инфицированных вирусом и обработанных флюорохромом. Сделайте рисунок препарата и укажите светящиеся точки-вирусы.

3 Используя световой микроскоп, рассмотрите фиксированный препарат нейтроцитов с включениями рабдовирусов (тельца Бабеша-Негри). Сделайте рисунок препарата и укажите тельца Бабеша-Негри.

Задание 2: изучите особенности электронной микроскопии и ее возможности при изучении морфологии и ультраструктуры вирусов.

Ход работы

1 Ознакомьтесь с приведенной ниже общей характеристикой метода электронной микроскопии.

Электронная микроскопия. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм; реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. На практике разрешение для биологических объектов достигает 2 нм.

В электронном микроскопе ви­русы идентифицируют по тонким деталям их ультраструктуры. С этой целью получают микрофотографии. При этом содержащий вирусы материал суспендируют в хорошо испаряющейся среде и наносят на сетку с подложкой, представляющей собой пленку из коллодия или из чистого углерода, слабо поглощаю­щую электроны. Улучшение электронно-микроскопического изображения вирусов достигается увеличением их электронной плотности путем воздействия на них паров четырехокиси осмия. Широко используются также методы напыления на вируссодержащие материалы тяжелых металлов (золото, палладий, уран), хорошо оттеняющих форму и объем вирусных частиц, и нега­тивного контрастирования вирионов нейтральными растворами фосфовольфрамата или уранилацетата, глубоко проникающими в их «извилины и зазоры». Наконец, конфигурация вирионов от­четливо отпечатывается на матрицах-репликах высохших пле­нок пластмассы, раствором которых они заливаются. Симмет­рию и распределение белковых субъединиц в блоке-ансамбле вирусных кристаллов изучают с помощью рентгеноструктурного анализа.

Просвечивающий электронный микроскоп (рисунок 11) состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны наблюдают на флюоресцирующем экране и регистриру­ют при помощи фотопластинки.

Сканирующий (растровый) электронный микроскоп РЭМ применяют для получения трёхмерного изоб­ражения поверхности исследуемого объекта. В РЭМ применяются электронные линзы для фокусировки электронного пучка в пятно очень малых размеров. Это пятно непрерывно обегает некоторый участок образца аналогично лучу, обегающему экран телевизионной трубки. Электрический сигнал, возникающий при бомбардировке объекта электронами пучка, используется для формирования изображения на экране телевизионного кинескопа или электронно-лучевой трубки. Увеличение (отношение размера изображения на экране к размеру области, обегаемой пучком на образце) составляет от 10 до 10 млн.

Рисунок 11 – Внешний вид и схема электронного микроскопа

2 Рассмотрите электронные микрофотографии вирусов (рисунки 12-15, демонстрационный материал).

Рисунок 12 – АденовирусыРисунок 13 – Вирусы гепатита А

Рисунок 14 – Вирусы гриппа

3 В протоколе занятия кратко опишите технологию электронной микроскопии.

Задание 3: изучите структуру вируса натуральной оспы.

Ход работы

1 Рассмотрите электронную микрофотографию вириона оспы (рисунок 16).

2 Изучите схему строения вируса натуральной оспы (рисунок 17) и найдите соответствия структурных элементов на схеме и фотографии.

3 Укажите на соответствующем рисунке протокола занятия сердцевину, капсид, суперкапсид вириона оспы и захваченные им фрагменты цитоплазматической мембраны.

Рисунок 15 – Электронная микрофотография фага эшерихии коли

Рисунок 16 – Вирион натуральной оспы (электронная микроскопия, ˟ 230 000)

Рисунок 17 – Схема строения вириона оспы:

1 – фрагмент цитоплазматической оболочки, захваченной вирионом при выходе из клетки; 2 – пространство между этой оболочкой и поверхностью вириона; 3 – внешняя осмиофильная мембрана оболочки вириона; 4 – сред­няя осмиофильная мембрана оболочки вириона; 5 – внутренняя мембрана обо­лочки вириона; 6 – боковое (лате­ральное) тело; 7 – фрагмент клеточной оболочки; 8 – внутривирусная гранула; 9 – локальное втяжение оболочки; 10 – тяж, связывающий компонент нуклеоида с оболочкой; 11 – вирусоплазма; 12 – внешняя осмиофильная мембрана обо­лочки нуклеоида; 13 – средняя осмиофобная мембрана оболочки нуклеоида; 14 – внутренняя осмиофильная мембра­на оболочки нуклеоида; 15 – нуклеоидоплазма; 16 – осмиофобный компонент S-образной структуры; 17 – кольцо – срез спиральной укладки ДНК (гипотеза); 18 – центр этого кольца; 19 – внутрен­ний компонент S-образной структуры нуклеоида; 20 – центральный компо­нент S-образной структуры нуклео­ида.