2014-09-04
571
Лабораторная работа (количественное определение
пировиноградной кислоты – видоизмененный метод Умбрайта).
Содержание пировиноградной кислоты /ПК/ в крови и тканях может изменяться при некоторых патологических состояниях – кислородной недостаточности, дефиците витамина В1 и других.
Определение ПК в крови основано на том, что она при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином образует 2,4-динитрофеназол - соединение желтого цвета. При добавлении спиртового раствора щелочи к толуоловому экстракту, содержащему это соединение, развивается оранжево-красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию ПК. Определяя оптическую плотность раствора, можно рассчитать содержание ПК с помощью калибровочного графика.
Ход работы. 1. Приготовить безбелковый фильтрат крови: в пробирку внести 2 мл 10% раствора трихлоуксусной кислоты и затем 0.4 мл крови, смешать и после 10-минутной экспозиции фильтровать через бумажный фильтр. 2. В сухую пробирку внести 1 мл фильтрата, добавить 0.5 мл 0.1% раствора солянокислого раствора 2,4-динитрофенилгидразина и через 5 мин прилить 2.5 мл водонасыщенного толуола. Энергично встряхивать 2 мин и оставить до расслоения. Из толуолового (верхнего) слоя отобрать 1 мл и перенести в сухую пробирку. Прилить 2 мл спиртового раствора щелочи.
|
|
|
Одновременно проводится контрольная проба – в неё вместо фильтрата крови вносится дистиллированная вода.
Оптическую плотность полученного в опыте раствора колориметрировать против контрольной пробы (кювета 5 мм, фильтр синий). По результатам определения оптической плотности устанавливают содержание ПК, учитывая, что 1 мл крови соответствует 0.2 мл безбелкового фильтрата.
Для построения калибровочной кривой вносят в последовательно пронумерованные пробирки 0.2, 0.4, 0.6, 0,8 и 1.0 мл стандартного раствора ПК, доводят каждую пробирку водой до 1 мл и проводят те же операции, что в опыте. При построении кривой откладывают на оси абсцисс количества ПК в исследуемом ряду пробирок, а на оси ординат найденные значения оптической плотности.
