Препарирование образцов для электронномикроскопического исследования

Цель работы - освоить наиболее распространенные методы препарирования объектов различного характера для просвечивающей электронной микроскопии.

Выбор метода препарирования

Наиболее широко распространенные электронные микроскопы просвечивающего типа I класса работают в диапазоне ускоряющих напряжений 100‒125 кВ. Энергии таких электронов недостаточно для прохождения сквозь объекты, толщина которых превышает 50‒100 нм вследствие сильного их поглощения и рассеяния. Этот факт накладывает своеобразный отпечаток на процесс подготовки образцов к просмотру в электронном микроскопе, называемый препарированием образцов.

Методы исследования в просвечивающей электронной микроскопии подразделяются на прямые и косвенные. В первом случае изучается сам объект, а во втором ‒ отпечаток его поверхности, называемый репликой. Выбор метода препарирования зависит от прозрачности объекта по отношению к пучку электронов (т. е. его толщины и рассеивающей способности исследуемого объекта), от реальных возможностей изготовления в случае непрозрачных объектов тонких пленок или слоев. Если объект слишком массивен, а изготовить из него тонкую пленку или слой невозможно, или при этом искажается информация, которую требуется получить, то приходится прибегать к методу реплик.

Прямые методы препарирования обычно применяют для определения формы, размеров, относительной толщины частиц, для исследования дефектной структуры твердых тел и для других специальных целей (например, при изучении микродифракции, картин Муара, съемок в темном поле и т. д.), а также для проведения электронографических исследований. С помощью прямых методов изучают тонкие пленки и ультратонкие срезы, различные мелкодисперсные вещества (порошки, дымы, суспензии, золи и т. п.), нанесенные тонким слоем на вспомогательные подложки. С помощью реплик можно изучить форму, размеры частиц, и кроме того, появляется дополнительная возможность исследовать рельеф поверхности различных твердых тел и пленок. Материал реплики отличен от материала объекта, и, следовательно, реплики непригодны для электронографического исследования.

При выборе метода препарирования необходимо учитывать не только характер ожидаемой в результате ЭМ исследования информации, но и реальные возможности препарирования, которые определяются тем, в каком состоянии находится исследуемый объект (массивный, пленочный, мелкодисперсный, грубодисперсный, наличие дисперсионной среды ‒ газ, жидкость), а также его механохимическими характеристиками (возможностью разрезать, измельчать без разложения, твердостью, хрупкостью, пластичностью, способностью к растворению, к ионному или плазмохимическому травлению).

Массивные объекты, которые можно разрезать без деформации и разрушения, удобно препарировать методом ультратонких срезов при наличии соответствующего прибора (ультрамикротома). Эти срезы наиболее широко применяются при изучении биологических объектов. Непосредственное изучение ультратонких срезов в электронном микроскопе относится к прямым методам исследования. Изготовить тонкие пленки из массивных объектов методами жидкостного химического травления или электрохимического травления довольно трудно. Лучшее качество изготовления пленок достигается методами послойного ионного травления, для обеспечения которого необходима специальная аппаратура. Если задачей исследования является изучение рельефа поверхности массивного образца, то наиболее простым методом препарирования является изготовление реплик.

Мелкодисперсные объекты при прямых методах препарирования наносят на тонкие (15‒20 нм) пленки-подложки, приготовленные из прозрачного для электронов материала. Наиболее часто в качестве последнего используют углерод, реже ‒ оксид кремния, коллодий (нитроцеллюлозу), формвар (поливинилформальдегид), полиметилметакрилат. Порядок нанесения объекта на полимерную подложку или углеродную пленку различен и описан в работе 1.. Операции нанесения мелкодисперсных объектов на пленки подложки описаны в работах [8,7].

Препарирование мелкодисперсных объектов методом реплик необходимо, если частицы образца непрозрачны в пучке электронов, но нужна или же не взаимодействуют с ним и просмотр в электронном микроскопе не дает информацияи об истинной форме частиц, а также о рельефе их поверхности. Кроме того, изготовление реплик необходимо, когда частицы образца собраны в агрегаты, а из-за их непрозрачности для электронов, невозможно разграничить отдельные составляющие агрегатов. Следует иметь в виду, что разрешение на ЭМ снимках реплик меньше, чем на снимках образцов, приготовленных прямыми методами. Пленки-реплики, применяемые в электронной микроскопии, изготавливают из тех же материалов, что и подложки для ЭМ и ЭГ исследований. К ним предъявляют те же требования (см. работу I). Кроме того, эти пленки не должны проявлять при ЭМ исследованиях собственной микроструктуры, что могло бы затруднить интерпретацию наблюдаемых картин. Пленки, используемые для изготовления реплик, должны с высокой точностью воспроизводить мельчайшие детали микрорельефа исследуемых образцов.

Пластиковые реплики получают нанесением раствора органического полимера в растворителе на исследуемую поверхность. При этом образуются пленки различной толщины на разных участках препарата, поскольку наружная поверхность растекающегося раствора стремится к образованию горизонтальной плоскости, а внутренняя поверхность повторяет впадины и выступы рельефа образца. Контрастное изображение реплики в электронном микроскопе создается за счет различного поглощения и рассеяния электронов на участках пленки разных толщин.

Углеродные реплики получают термическим испарением углерода в вакууме по методике, описанной в работе I. При препарировании для ЭМ исследования углеродную пленку напыляют на исследуемый образец, что обеспечивает хорошую адгезию образца к пленке, а также дает дополнительный контраст, поскольку углеродная пленка имеет толщину, различающуюся на разных элементах поверхности объекта. Усилить контраст можно, напыляя углеродную пленку под небольшим углом к поверхности объекта, а также распыляя одновременно с углеродом небольшое количество тяжелого металла (Pt, Сг, Аu). Такие реплики называются самооттененными. Для выявления тонких деталей рельефа поверхности массивных объектов образцы перед препарированием шлифуют и/или протравливают в растворителе. В тех случаях, когда исследуемый объект состоит из компонентов разной химической природы, полезно изготавливать реплики с извлечением частиц, что дает возможность отличить на ЭМ-снимках одну фазу от другой. Для изготовления таких реплик углеродную пленку, содержащую частицы разных компонентов, обрабатывают в растворителе, взаимодействующем с одной из фаз, но не действующем на другую. В результате в пленке наблюдаются контрастные частицы одной фазы и малоконтрастные отпечатки частиц другой фазы.

Порядок проведения операций препарирования.

При прямом препарировании на мелкодисперсный объект, нанесенный на вспомогательную подложку (свежий скол монокристалла хлорида натрия, слюду, стекло), напыляют в вакуумном посту углеродную пленку толщиной ~15 нм. Затем проводят отделение пленки от вспомогательной подложки (в холодной, горячей воде или в плавиковой кислоте соответственно).

При получении реплики легкорастворимого объекта независимо от того, массивен он или мелкодисперсен, на него также наносят углеродную пленку, отделяют при необходимости от вспомогательной подложки, а затем растворяют объект в подходящем растворителе, выдерживая объект на его поверхности до полного растворения. Далее полученный углеродный отпечаток промывают в воде с небольшим количеством спирта или ацетона, предотвращающих разрыв пленок.

В случае труднорастворимых массивных объектов углеродную реплику можно отделить механическим путем с помощью клея. В качестве такого клея удобно использовать 7‒8 % раствор желатины, которыйая наносятится на объект с углеродной пленкой в виде капель. Раствор быстро высушивают (50‒70 °С, 30‒40 мин). Быстрая сушка обеспечивает легкость отслаивания желатины вместе с углеродной пленкой от поверхности образца. Чтобы пленка желатины была прочной, капли ее раствора должны быть выпуклыми, не сливаться друг с другом. Для предотвращения разрыва углеродной пленки эти капли наносят палочкой, не дотрагиваясь до поверхности объекта. Пленку желатины вместе с прилипшим к ней углеродным отпечатком помещают на поверхность горячей воды, нагревая ее постепенно до 70‒80 °С (желатиной к воде). Процесс растворения продолжается 10‒15 мин. Углеродная пленка без остатков желатины не прилипает к игле и легко ею разрывается. Полученные реплики промывают в свежей порции воды, принимая меры для предотвращения разрыва пленки. В ряде случаев в углеродную пленку, отделенную с помощью желатины, остаются вкрапленными частицы, находившиеся на поверхности массивного объекта. В случае шероховатых поверхностей отделить углеродные пленки с помощью желатины не удается.

Массивные труднорастворимые объекты с шероховатой поверхностью препарируют методом двухступенчатых реплик. Его можно исполнить несколькими способами. По одному из них на чистую поверхность исследуемого образца наносят раствор полимера в растворителе (например, полиметилметакрилата в его мономере). После высыхания раствора образующуюся достаточно толстую и механически прочную пленку отслаивают и напыляют на сторону, содержащую отпечаток поверхности, углеродную пленку под малым углом потока атомов углерода к поверхности образца для создания большого контраста (т. е. перепада толщины углеродной пленки на разных участках полимерного отпечатка). Пластиковую пленку затем удаляют с углеродной реплики в подходящем растворителе.

Можно использовать также готовые пластиковые пленки, которые в результате набухания в подходящем растворителе приобретают высокую пластичность и при приклеивании к поверхности объекта воспроизводят ее рельеф. Примером такой пленки может быть нитроцеллюлоза, легко набухающая в ацетоне. Эту пленку после смачивания ацетоном приклеивают на исследуемую поверхность. После испарения ацетона пленку снимают и напыляют углерод на сторону с отпечатком, приклеив предварительно пленку, например, липкой лентой, к стеклу. Удаление нитроцеллюлозы со вторичного углеродного отпечатка проводят в ацетоне. Углеродную реплику, находящуюся в объеме ацетона, захватывают петлей и переносят в воду для промывки.

В качестве материала для двухступенчатой реплики можно также использовать пленки из металла, получаемые путем термического испарения в вакууме на исследуемую поверхность. Для придания таким пленкам достаточной механической прочности, обеспечивающей возможность отслаивания от объекта исследования без повреждений, толщину пленки металла делают равной 100‒200 нм. Далее, после отслаивания металлической пленки от объекта на поверхность с отпечатком напыляют углеродную оттененную пленку толщиной ~15 нм, а металл растворяют в подходящем растворителе, после чего промывают полученную углеродную реплику в воде.

Задание для экспериментальной работы

Приготовьте препараты:

1) мелкодисперсного образца прямым методом,

2) мелкодисперсного или массивного образца методом реплик с растворением объекта,

3) массивного объекта методом реплик с отделением углеродной пленки от подложки с помощью желатины,

4) массивного объекта двухступенчатым методом.

Изучите препараты с помощью просвечивающего электронного микроскопа