Определение декстриногенной активности свежепроросшего солода

Солод готовят к анализу, переводя в раствор амилолитические ферменты. Для этого готовят основной (I) и рабочий (II) растворы. Для приготовления основного раствора навеску измельченного свежепроросшего солода (просяного – 10 г, ячменного, овсяного или ржаного – по 5 г) переносят в коническую колбу на 200 – 250 см³, заливают 10 см³ фосфатного буфера и 90 см³ дистиллированной воды. Смесь выдерживают 1 час при температуре 30°С при периодическом перемешивании стеклянной палочкой, затем фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат представляет собой основной раствор I. Рабочий раствор ферментов солода II готовят из основного раствора, разбавляя его водой так, чтобы в рабочем растворе, введенном в реакцию, содержалось количество ферментов, обеспечивающих гидролиз крахмала в принятых условиях, на 20 – 70% (таблица 2).

Таблица 2 – Приготовление рабочего раствора солода

Аппаратура и реактивы. Фотоэлектроколориметры ФЭК-60, КФК-2МП; фосфатный буферный раствор рН 4,7–4,9 (для приготовления раствора отвешивают 11,876 г гидроортофосфата натрия Nа₂НРО₄ и 9,079 г дигидрофосфата калия КН₂РО₄. Навески солей растворяют раздельно в дистиллированной воде в колбах на 1 дм³ и доводят содержимое до метки – получают растворы солей I и II. Для получения буферного раствора с рН 4,85 перед анализом растворы I и II смешивают в соотношении 1: 1); 0,1 моль/дм³ раствор НСl; раствор йода для йод-крахмальной реакции (вначале готовят основной раствор йода, для чего 0,5 г кристаллического йода и 5 г йодида калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с пробкой на 200 см³ и доводят водой до метки. Раствор перемешивают и оставляют на хранение в темном месте. По мере необходимости из него готовят рабочий раствор путем разбавления 2 см³ исходного раствора 0,1 моль/дм³ раствора НСl в мерной колбе на 100 см³. При этом определяют оптическую плотность рабочего раствора при длине волны 453 нм в кювете с длиной рабочей грани 10 мм: она должна быть 0,220 ± 0,01 (ФЭК-60). В необходимых случаях ее доводят до требуемой добавлением нескольких капель кислоты или основного раствора йода, который хранят не более 30 суток); 1%-й раствор крахмала (для приготовления субстрата необходимо взять такое количество воздушно-сухого растворимого картофельного крахмала, которое содержало бы 1 г сухого вещества). При известной влажности W воздушно-сухого крахмала величина его навески составит 1×100:(100–W) г. Навеску крахмала переводят в мерную колбу на 100 см³, добавляют в нее 25 см³ воды и перемешивают. Затем добавляют еще 25 см³ воды и колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин, непрерывно перемешивают содержимое до полного растворения крахмала. Затем колбу охлаждают и в нее добавляют 10 см³ фосфатного буферного раствора (рН 4,8 – 4,9). Раствор доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и используют для проведения анализа. Его готовят в день проведения анализа. Допускается хранение субстрата в холодильнике и употребление в течение 5 – 10 дней после его приготовления. В этом случае каждый раз субстрат кипятят 5 – 7 минут для растворения студня, а затем охлаждают и используют в опыте. Качество полученного субстрата контролируют по реакции с йодом. Для проверки D-субстрата в пробирку наливают 10 см³ 1%-го раствора крахмала и добавляют 5 см³ дистиллированной воды, смесь хорошо перемешивают. Затем в коническую колбу наливают 50 см³ раствора рабочего йода и 0,5 см³ смеси. Полученный окрашенный раствор колориметрируют на ФЭК при l=656 нм в кювете с длиной рабочей грани 10 мм по сравнению водой. D должно быть не менее 0,70.

Ход определения. В две пробирки диаметром 2 см и высотой 18 см наливают 10 см³ субстрата и помещают их в ультратермостат или водяную баню с температурой 30±0,2⁰С на 10 минут. Затем, не вынимая пробирок из термостата, в первую добавляют 5 см³ дистиллированной воды (контрольная проба), а во вторую – 5 см³ рабочего раствора фермента II (испытуемая проба). Смеси быстро перемешивают и выдерживают при температуре 30⁰С в течение 10 минут, отмечая время по секундомеру. Спустя 10 минут пробирки вынимают из термостата и из каждой отбирают по 0,5 см³ прогидролизованного раствора раздельно в две колбы, в которые предварительно наливают по 50 см³ рабочего раствора йода, приготовленного на разбавленной соляной кислоте. Содержимое колб перемешивают. Соляная кислота сразу прерывает действие ферментов. Полученные растворы приобретают различную окраску: контрольный имеет синий цвет, а опытный – фиолетовый цвет различной степени интенсивности в зависимости от количества прогидролизованного крахмала по отношению к дистиллированной воде. Для работы используют кюветы с длиной рабочей грани 10 мм и красный светофильтр (l = 656 нм). Значение D₁ должно быть не менее 0,690.

Количество прогидролизованного крахмала С (в г) вычисляют из соотношения

0,1: С = D₁: (D₁ – D₂), откуда С = 0,1 × (D₁ – D₂): D₁,

где 0,1 – количество исходного крахмала, введенного в ферментативную реакцию, г;

D₁ – оптическая плотность контрольного раствора (раствор крахмала и воды);

D₂ – оптическая плотность опытного раствора с ферментом.

Если количество прогидролизованного крахмала С окажется меньше 0,02 или больше 0,07 г, опыт повторяют с большим или меньшим количеством основного раствора фермента I. Если же 0,02 < С< 0,07, то ДАК свежепроросшего солода (в ед/г) вычисляют по формуле

ДАК = (6,889 × С – 0,029388) × 1000: Н,

где 6,889 и 0,029388 – коэффициенты рабочего уравнения, математически описывающего прямолинейную зависимость количества прогидролизованного крахмала от количества ферментов солода, взятого для эксперимента. В коэффициенты введен множитель для пересчета на 1 ч действия фермента;

1000 – коэффициент пересчета в г;

н – количество исходного солода, участвующего в сфере ферментативной реакции, мг.

Для расчета ДАК в международных стандартных единицах принимают условно, что молекулярная масса крахмала соответствует молекулярной массе остатка глюкозы (180 – 12 = 162). В этом случае за единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль крахмала за 1 мин в условиях опыта. Пересчет одной условной единицы активности с размерностью г/ч/г на стандартные международные единицы с размерностью мкмоль/мин/г осуществлен следующим образом: 1 ед/г = 10⁶: 162 × 60 = = 103 мкмоль/мин/г, где 10⁶ – перевод граммов в милиграммы; 162 – условное значение молекулярной массы крахмала; 60 – перевод времени действия фермента в минуты. Из этих расчетов видно, что условная единица равна 103 стандартным международным.

Пример. Требуется определить ДАК ячменного солода влажностью 40% среднего качества, если D₁ = 0,725, D₂ = 0,500, а расход основного раствора ферментов солода I для приготовления рабочего раствора II составил 2 см³.

Проверяем, удовлетворяет ли величина прогидролизованного крахмала условиям эксперимента: С = (0,725 – 0,500) × 0,1: 0,725 = 0,031, т.е. 0,02< С < 0,07.

Количество солода Н, участвующее в реакции, равно 5 × 2 × 5 × 1000 :: (100 × 50) = 10 мг.

Декстриногенная активность исследуемого солода составляет:

ДАК = (6,889 × 0,031 – 0,029388) × 1000: 10 = 18,42 ед/г.

В пересчете на абсолютно сухое вещество ДАК = 30,7 ед/г.