Поляриметрический метод определения осахаривающей активности

Метод основан на определении поляризации субстрата, обработанного ферментами солода или ФП, в сравнении с контролем. За единицу осахаривающей активности ОАК принимается такое количество фермента, которое гидролизует при температуре 50⁰С в течение 30 минут при рН 4,7 – 4,9 до низкомолекулярных углеводов 1 г крахмала субстрата, составляющего 10% от введенного в реакцию.

Определение осахаривающей активности свежепроросшего солода

Вначале готовят вытяжку и фильтрат ферментов из солода, как и при определении ДАК. При работе с солодами применяют фосфатный буферный раствор. Для анализа используют рабочие растворы ферментов.

Реактивы и аппаратура. Субстрат – 2%-й раствор растворимого картофельного крахмала; 30%-й раствор сульфата цинка; 15%-й раствор гексациано-(II)-феррата калия; 1 моль/дм³ раствор соляной кислоты; фосфатный буферный раствор с рН 4,7 – 4,94; ультратермостат; сахариметр СУ‑3.

Ход определения. В две пробирки (d = 18 мм, l = 180 мм) наливают по 20 см³ субстрата; субстрат инкубируют в ультратермостате при температуре 50⁰С в течение 5 – 10 минут. Затем к содержимому одной пробирки добавляют 10 см³ рабочего раствора ферментов, перемешивают и выдерживают в термостате при температуре 50±0,2⁰С точно 30 минут. Затем быстро инактивируют ферменты добавлением 1 см³ 1 моль/дм³ соляной кислоты и осаждают оптически активные несахара двойным осадителем. Для этого приливают в пробирку 1 см³ сульфата цинка и после перемешивания – 1 см³ раствора гексациано-(II)-феррата калия; содержимое пробирки охлаждают до температуры 20⁰С.

Одновременно в другой пробирке готовят контрольный раствор по схеме: 10 см³ раствора фермента, 1 см³ раствора 1 моль/дм³ соляной кислоты, по 1 см³ осадителей и 20 см³ субстрата. Работа ведется при температуре 20⁰С.

Содержимое пробирок перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр. Испытуемый и контрольный фильтраты поляризуют в трубке длиной 200 мм. Определив поляризацию контрольного (П_к) и испытуемого (П_о) растворов, вычисляют разность угла вращения DП плоскости поляризации этих растворов: DП = П_к - П_о. Значение DП на поляриметре СУ-3 должно быть не менее 0,2⁰.

При анализе солодов для расчетов ОАк_п применяют уравнение

ОАК_п = (0,050DП + 0,0114) × 10³: Н,

где 0,050 и 0,0114 – коэффициенты, найденные опытным путем;

Н – количество солода в реакционной среде, мг.

Пример. Определить ОАк_п ячменного солода влажностью 42%, если на приготовление 100 см³ основного раствора ферментов израсходовали 5 г солода.

Основной раствор разбавлен в 20 раз (5 см³: 100 см³). Следовательно, в реакцию введено Н = 5 × 5 × 10 × 1000: (100 × 100) = 25 мг солода.

При поляризации фильтратов субстрата на поляриметре СУ – 3 получено П_к = 14,1⁰, П₀ = 12,6⁰ и DП = 14,1 – 12,6 = 1,5⁰.

Тогда осахаривающая активность влажного солода

ОАк_п = (0,050 ×1,5 + 0,0114) × 10³: 25 = 3,45 ед/г, или в пересчете на абсолютно сухое вещество ОАк_п = 3,45 × 100: (100 – 42) = 5,95 ед/г.

Ячменный солод с ОАк_п = 3,45 ед/г относится к солодам среднего качества.

Поляриметрический метод, предусматривающий гидролиз при высокой температуре (50⁰С), позволяет достаточно точно установить за 30 мин изменение состава субстрата по его поляризации.

Благодаря небольшой длительности метода, малому числу операций, использованию оптического прибора он получил широкое распространение в спиртовой промышленности. Точность метода несколько ниже, чем йодометрического, и составляет 5 – 7%.

Таблица 3 – Изменение активности амилолитических ферментов ячменного солода при прорастании

Лабораторная работа № 4