Задания к лабораторному занятию. Произвести заражение на хорионаллантоисную оболочку куриного эмбриона вирусом осповакцины

Произвести заражение на хорионаллантоисную оболочку куриного эмбриона вирусом осповакцины.

2. Провести заражение в аллантоисную полость куриного эмбриона вирус

содержащим материалом.

3. Освоить технику вскрытия куриного эмбриона.

4. Определить репродукцию вируса в курином эмбрионе и клеточной культуре по ЦПД вируса.

РАЗДЕЛ "ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ"

Тема: Распространение микроорганизмов в природе

Цель: Изучение методов санитарно-бактериологического исследования почвы, воды, воздуха

Вопросы для самоподготовки

1. Микрофлора почвы.

2. Микрофлора воды.

3. Микрофлора воздуха.

4. Санитарно-микробиологический анализ почвы.

5. Санитарно-микробиологический анализ воды.

6. Санитарно-микробиологический анализ воздуха.

7. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах окружающей среды.

Литература

1. Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробио­ло­гия. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 143-147.

2. Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руково­дство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 74-84.

В природе микроорганизмы распространены везде, где они находят условия для роста и размножения. При отсутствии таких условий, микроорганизмы могут лишь временно сохранять свою жизнеспособность. Наиболее благоприятные для жизнедеятельности микробов условия имеются в почве, богатой органическими веществами. Наибольшее количество микроорганизмов наблюдается на глубине 5-15 см от её поверхности. В почве обитают грибы, водоросли, бактерии, фаги, простейшие. Микроорганизмы почвы играют большую роль в круговороте веществ в природе. Почва является основным резервуаром микроорганизмов в природе. Из неё микроорганизмы могут попадать в воду, воздух, на листья растений, лекарственного растительного сырья и т. д. В прибрежных и поверхностных водах открытых водоёмов содержится также большое количество микроорганизмов. Водоёмы, располагающиеся возле крупных городов, а также животноводческих ферм, как правило, богаты микроорганизмами в результате их загрязнения канализационными и сточными водами.

Воздух не является благоприятной средой для обитания микробов. Поэтому большинство микроорганизмов могут находиться в нём лишь некоторое время.

Патогенные микроорганизмы, обитающие в организме больных или носителей попадая в почву и воду с выделениями (моча, кал), в воздух при разговоре, кашле, чихании могут сохраняться там, в течение определённого времени. В этом случае окружающая среда становится фактором передачи патогенных микробов.

Санитарно-микробиологические исследования почвы проводят с целью определения ее санитарно-гигиенического состояния, а также для эпидемиологических исследований, выявления путей заражения и сроков выживаемости патогенных микроорганизмов, загрязнения грунтовой воды и открытых водоёмов.

Санитарно-микробиологические исследования воды проводят с целью санитарного контроля и по эпидемиологическим показаниям на наличие патогенных кишечных бактерий (сальмонелл, шигелл), энтеровирусов и показателей свежего фекального загрязнения.

Санитарно-микробиологические исследования воздуха проводят с целью определения биологического показателя загрязнения его микрофлорой носоглотки человека, а также непосредственного обнаружения патогенных стафилококков, синегнойных палочек, других грамотрицательных условно-патогенных бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций. На предприятиях микробиологической промышленности изучается содержание в воздухе микроорганизмов-продуцентов. Например, на ферментных заводах – грибов рода Aspergillus и споровых бактерий.

Точное количественное определение бактерий в почве, воде, воздухе затруднено в связи с тем, что невозможно создать условия для размножения всех встречающихся в исследуемом материале микроорганизмов, которые отличаются между собой по типам дыхания, питания. Поэтому большое значение для санитарно-микробиологической оценки внешней среды имеют санитарно-показательные микроорганизмы, которыми являются представители нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных. Эти микроорганизмы легко поддаются обнаружению и определению количественными методами и служат показателем загрязнения окружающей среды выделениями человека.

Для почвы санитарно-показательными микроорганизмами являются кишечная палочка – E. coli, Streptococcus faecalis, Clostridium perfrigens. Для воды санитарно-показательными микроорганизмами выбраны – E.coli, Streptococcus faecalis; для воздуха – Streptococcus haemolyticus, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus.

Методы санитарно-микробиологического анализа почвы включают количественный учет сапрофитных бактерий, по которому судят о микробном числе почвы; определение количества бактерий группы кишечных палочек методами титрации, мембранных фильтров, методом прямого поверхносного посева; определение Cl. perfringens, сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка и ботулизма.

При учете численности микроорганизмов почвы применяют диспергирование в воде находящихся в почве бактерий. В асептических условиях, пробы почвы измельчают, растирают в ступке и готовят для чистых почв до 3-4 десятикратных разведений в стерильной водопроводной воде. При определении микробного числа почвы (это количество микроорганизмов, содержащиеся в 1г. почвы) должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений, в зависимости от предполагаемого загрязнения исследуемой почвы.

Перед посевом каждое разведение в пробирках перемешивают стерильной пипеткой, затем из него отбирают 1мл. и переносят на дно стерильной чашки Петри. Каждое разведение вносят не менее чем на 2 чашки, в которые затем вливают 7-10мл. растопленного и остуженного до 45°С МПА или сусло-агара. Расплавленный агар перемешивают с имеющейся взвесью почвы с помощью покачивания чашки. Отмечают разведение пробы и инкубируют при температуре 28-30 ºС в течение 24 часов. Для удобства подсчета следует брать те разведения при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний. В качестве примера можно привести следующую схему заполнения протокола.

Таблица1

Наименование участка	Количество подсчитанных бактерий в разведениях 1:10000	Число бактерий в 1г почвы (Микробное число)
Двор аптечного учреждения	70 среднее 80

Микробное число почвы показывает общую численность в основном сапрофитных микроорганизмов, вырастающих на МПА или сусло-агаре. Для определения коли-титра почвы (наименьшее количество исследуемого материала в граммах, в котором обнаруживается жизнеспособная E. coli) используют элективные питательные среды, содержащие желчь и другие компоненты, тормозящие рост большинства микробов, населяющих почву, кроме кишечной палочки.

Метод титрации предполагает засев первоначального разведения почвенной суспензии 1:10 во флаконы с 50мл. жидких сред, что соответствует 1г. почвы.

Чаще всего используют посев почвы в лактозный бульон с 1,5мл и 2% водного раствора ТТХ (2-3,5трифенилтетразолия хлорида). Кишечная палочка способна восстанавливать ТТХ бесцветное соединение в трифенолформазан, выпадающий в виде осадка придающего среде красно-коричневый цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, который тормозит рост большинства микробов. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37ºС. При наличии в среде ТТХ газообразования и изменения цвета среды на кирпично-красный производят посев на среду Эндо или розоловый агар. При наличии на среде Эндо розовых или красных колоний грам-отрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью осуществляют их подсчет. Для подтверждения их ферментативной способности делают посев выросших колоний на полужидкую среду с глюкозой, затем на 24 ч. помещают при температуре 37°С. В случае появления в среде кислоты и газа исследование на наличие кишечных палочек считается положительным. Результат анализа выражают коли-титром.

Можно использовать другой метод посева соответствующих разведений почвенной суспензии – на среду Кеслера-Свенертона с последующей экспозицией в течение 24-48 ч. при температуре 37 ºС. После чего в случае газообразования и помутнения на среде Кеслера-Свенертона так же производят высев на среду Эндо или розоловый агар. Дальнейший ход исследований полностью совпадает с выше-описанным.

Метод мембранных фильтров

Этот метод позволяет сократить время анализа на двое суток благодаря исключению этапа накопления микроорганизмов на жидких средах. При анализе почвы в небольших разведениях (1:10; 1:100), чтобы избежать накопления на фильтрах накопления почвенных частиц, мешающих выявлению кишечной палочки при выращивании на фильтре, на мембранный фильтр накладывают предварительный планктонный фильтр. Подсчет колоний осуществляют на тех фильтрах, где из соответствующего разведения выросло не более 30-50 колоний. Затем осуществляют пересчет выращенных на фильтрах колоний на 1г. почвы.

Метод прямого поверхностного посева применяют при анализе загрязненных почв. Для этого среду Эндо разливают в чашки Петри, подсушивают в сушильном шкафу. Готовят почвенную суспензию, как указанно ваше, используя разведение до 1:1000000. Посевы выращивают при температуре 37 ºС в течение 24 часов. Затем производят подсчет розовых и красных колоний с металлическим блеском. Для более точного определения соответствующие бактерии должны быть изучены по схеме, которая применяется при исследовании воды. При необходимости перевода коли-индекса в титр кишечной палочки необходимо 1000 разделить на число, выражающее коли-индекс.

Определение Clostridium perfringens

Готовят почвенные разведения до 1:100000, которые переносят по 1мл. в два ряда пробирок. Один ряд прогревают в течение 15 мин. при 80 ºС или 10 мин. при 90 ºС. Затем во все пробирки вносят по 10 мл. расплавленной и охлажденной до 45 ºС среды Вильсона-Блер и вращением пробирки между ладонями равномерно распределяют почвенную суспензию и быстро опускают в холодную воду для быстрого охлаждения и удаления воздуха из среды. Учет колоний можно начинать через 2 часа экспозиции при 43 ºС. В глубине агара вырастают черные колонии, разрывающие среду в следствии газообразования. В приготовленных из этих колоний мазках Cl.рerfringens определяются в виде характерных грам-положительных палочек.

Другой метод определения Cl. рerfringens в почве производится с использованием сульфит-полимиксиннеомициновой среды (СПН). Инкубация посевов проводится при 44-45 ºС в течение 10-12 часов. Дальнейшая идентификация выросших колоний не требуется.