2015-02-27
1081
В качестве реципиента используют культуру стрептомицинчувствительных сенных палочек Bacillus subtilis. Донором является ДНК, выделенная из стрептомицинрезистентного штамма сенной палочки. Селективной средой для отбора трансформантов служит агар, содержащий 100 ЕД стрептомицина.
Для осуществления трансформации к 1 мл бульонной культуры сенной палочки добавляют 1 мкг./ мл ДНК донора и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. После этого на 5 минут в пробирку вносят 0,1 мг/ мл раствора фермента ДНК-азы в 0,5 мл хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиента. Затем 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Чтобы определить количество клеток реципиентной культуры, готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10–5-10-6 и высевают в объёме 0,1 мл на агар без стрептомицина. При этом контролем служит посев на агар со стрептомицином, на котором чувствительная культура не должна расти. После инкубации при 37 °С в течение 24 часов определяют частоту трансформации по отношению числа выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.
|
|
|
Например, если при высеве 0,1 мл культуры штамма-реципиента, разведенного до 10–5 микробных клеток, выросло 170 колоний, а при высеве неразведенной взвеси – 68 колоний, частота трансформации в этом случае будет равна:
,
где числитель – содержание рекомбинантных клеток в 1 мл смеси;
знаменатель – содержание клеток реципиента в 1 мл культуры сенной палочки.
