Постановка опыта специфической трансдукции

В качестве реципиента берут лактозоотрицательный штамм (E. сoli lac^–) без галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг обозначают как фаг, в геноме которого часть генов замещена β-галактозидазным опероном E.coli. Фаг является дефектным и неспособен вызывать продуктивную инфекцию с лизисом кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, в то время как лактозоположительные приобретают красный цвет с металлическим оттенком. Для осуществления специфической трансдукции к 1 мл трёхчасовой бульонной культуры реципиента добавляют 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10⁶-10⁷ частиц в 1 мл. После чего смесь инкубируют при 37°С в течение часа. Затем в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий для получения сосчитываемого количества колоний готовят десятикратные разведения. Из пробирки с разведением 10^–6 высевают по 0,1 мл на три чашки Петри с селективной средой и равномерно распределяют посев шпателем по её поверхности. После инкубации посевов в течение 24 часов вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток трансдуктантов, обнаруженных на всех чашках, к числу клеток штамма-реципиента, исходя из того, что каждая колония образовалась в результате размножения только одной бактериальной клетки. Например, если после посева 1 мл смеси реципиента и трансдуцирующего фага в разведении 10^-6 на трёх чашках со средой Эндо выросло соответственно 170, 138 и 160 бесцветных колоний, а на первой и третьей пять и одна колония трансдуктантов красного цвета, частота трансдукции будет составлять:

Постановка опыта конъюгации для передачи R – плазмиды, которая контролирует множественную устойчивость к стрептомицину (Str^r), тетрациклину (Тс^r) и хлорамфениколу (Сm^r). В качестве донора используют лейциноотрицательный антибиотикорезистентный штамм кишечной палочки E. coli К12 R+ leu- Str^r Tc^r Cm^r, а реципиент – E. coli К12 R- leu+ Str^r Tc^S Cm^S. Для постановки опыта в стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора и реципиента. После инкубации смеси при 37^оС в течение двух часов её высевают в объёме 0,1 мл на чашку с селективной минимальной глюкозосолевой средой и тремя антибиотиками в концентрации по 50 мкг/мл каждого. На данной среде вырастут только рекобинантные колонии (трансконъюганты), которые приобрели резистентность к стрептомицину, тетрациклину и хлорамфениколу. Донорский штамм не вырастет на этой среде потому, что он нуждается в лейцине, а реципиентный штамм – чувствителен к антибиотикам. Частоту формирования трансконъюгантов можно определить по отношению числа рекомбинантных клеток к числу клеток штамма – реципиента рис. 2). Можно привести пример определения частоты формирования трансконъюгантов. Если при высеве 0,1 мл культуры штамма-реципиента в разведении 10^-4 на глюкозосолевую среду с лейцином, образовалось 20 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси – 60 колоний трансконъюгантов, частота их формирования определяется так: