Метод иммунного окрашивания после переноса на нитроцеллюлозные мембраны (иммуноблоттинг)

Этот метод применяется для количественного определения белков и гликопротеинов, которые после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле переносят на микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Неспецифически связанные с мембраной антигены обрабатывают специфическими антителами, связывание которых проявляют антиглобулиновыми антителами, конъюгированными с радиоактивной или ферментной меткой.

Схема последовательных этапов иммуноблоттинга

Методика.

· Лоскут нитроцеллюлозной мембраны, соответствующий по размерам пластинке геля, смачивают, погрузив целиком в буфер на 20 мин.

· Приготовленный к блоттингу гель также погружают в буфер для насыщения на 20 минут.

· На пористую прокладку накладывают 1-2 смоченных буфером листа фильтровальной бумаги.

· Сверху на фильтровальную бумагу помещают пластинку геля

· На гель накладывают нитроцеллюлозную мембрану, тщательно следя за тем, чтобы между гелем и мембраной не образовались пузырьки воздуха.

· Поверх мембраны накладывают два листа фильтровальной бумаги и завершают приготовление «сэндвича» еще одной пористой прокладкой.

· Кассету с «сэндвичем» погружают в камеру для блоттинга, наполненную буфером. При переносе из геля, содержащего ДСН, в буфере с рН 8,3 молекулы белков имеют отрицательный заряд и движутся к положительно заряженному аноду. Поэтому необходимо проследить, чтобы мембрана прилегала к гелю именно со стороны анода.

· Закончив перенос, «сэндвич» раскладывают, отделяя гель и мембрану друг от друга.

· Окрашивают гель кислотным (кумасси) ярко-синим, чтобы определить насколько полно прошел перенос белков.

· Для выявления белков; перенесенных на мембрану, последнюю окрашивают 0,55% раствором амидочерного в смеси метанол-уксусная кислота-вода (1:5:1) в течение 3 мин. Затем отмывают в воде и обесцвечивают смесью ментол-уксусная кислота-вода (9:2:100).

· Прежде чем инкубировать мембрану с препаратами специфических антител, необходимо заблокировать все ее участки неспецифической адсорбции белка. Для этого нитроцеллюлозную мембрану инкубируют на качалке в течении 2 ч. при комнатной температуре в буфере, содержащем блокирующий раствор. Для удаления избытка постороннего белка мембрану дважды ополаскивают в буфере.

· Антитела растворяют в буфере.

· Полоски мембраны помещают между двумя листками термоплавкой пленки и запаивают с трех сторон. Наполняют сделанный таким образом чехол раствором антител, удаляют пузырьки воздуха и запаивают сверху.

· Полоски мембраны инкубируют в растворе антител в течение 1-2 ч при комнатной температуре. После инкубации полоски мембраны в течение 15-30 мин промывают в 3-5 сменах буферного раствора.

· После отмывания полоски мембраны инкубируют в растворе биотинированных антител в течение 1 часа при комнатной температуре. Если используем антиглобулины, меченые ¹²⁵J, инкубацию рекомендуется продлить до 6-16 часов.

· Полоски мембраны отмывают так же, как после инкубации с первыми антителами. Если вторые антитела были помечены ¹²⁵J, то полоски мембраны после отмывания высушивают. Высушенную мембрану помещают на фильтровальную бумагу, накрывают рентгеновской пленкой и экспонируют.

· Для выявления антигенов, связавших через первые антитела вторые биотинированные антитела, полоски мембраны инкубируют с биотинированным ферментом (пероксидаза хрена) в присутствии авидина или стрептавидина, через молекулы которых фермент присоединяется к антителам. Инкубируют в течение 1 часа при 4^оС.

· После инкубации полоски мембраны дважды отмывают в буфере.

· На полоски мембраны наносят раствор диаминобензидина с 0,33% Н₂О₂.

· Цветная реакция развивается в пределах 1-15 мин после добавления субстрата. Для остановки реакции полоски мембраны дважды отмывают в дистиллированной воде и высушивают.

· Полоски мембраны следует защищать от света, иначе возможно их выцветание.