Иммунизация мышей антигеном

Мышам многократно, по определенной схеме, вводят антиген внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно. Для иммунизации подходят любые схемы введения антигена, которые стимулируют формирование гуморального иммунного ответа, опосредованного В-лимфоцитами селезенки. Клетки селезенки получают, как правило, на 4 день после последней инъекции антигена.

2. Получение клеток селезенки мышей

а) Убейте мышь цервикальной дислокацией или усыпите в сосуде (15 мин с эфиром при закрытой крышке).

б) Закрепите мышь на парафиновой панели, вcкройте брюшную полость, извлеките пинцетом селезенку (с соблюдением правил асептики) и поместите в гомогенизатор, в который предварительно внесите 5 мл среды для слияния клеток (содержит аминокислоты, витамины, углеводы, неорганические соли).

в) Получите суспензию клеток селезенки, растирая ее пестиком о стенки гомогенизатора. Из каждой селезенки обычно получают 5´10⁷ клеток.

г) Отберите стерильной пипеткой 1 каплю взвеси клеток из гомогенизатора, приготовьте препарат «раздавленная капля» и промикроскопируйте клетки.

д) Перенесите полученную суспензию клеток селезенки в стерильные центрифужные пробирки и отмойте их при центрифугировании. Для этого клетки осадите в течение 5 мин при 1500 об/мин, слейте надосадочную жидкость в колбу-приемник, ресуспендируйте осадок в 1 мл среды для слияния.

3. Гибридизация и культивирование гибридом

а) Внесите к 1 мл полученной суспензии клеток селезенки равный объем взвеси миеломных клеток (концентрация 10 клеток/мл), тщательно перемешайте и осадите клетки центрифугированием в течение 5 мин при 1500 об/мин.

б) Надосадочную жидкость слейте в колбу-приемник, осадок клеток ресуспендируйте в 1-2 каплях среды для слияния, добавьте по каплям 1 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ) и 4 мл среды того же состава, добиваясь равномерного распределения клеток во всем объеме.

в) Осадите клетки при центрифугировании указанным выше способом и слейте надосадочную жидкость в колбу-приемник.

г) Осадок аккуратно ресуспендируйте в 10 мл селективной среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), которая способствует выживанию только гибридных клеток.

д) Отберите из суспензии пробы по 0,2 мл и внесите в лунки микропланшет. Культуры клеток инкубируют в атмосфере СО₂ при 37ºС в течение 15-18 суток. Начиная с 4 дня, необходимо менять питательную среду в лунках. Быстрорастущие клоны в виде плотных колоний клеток становятся различимыми на 5-6 день. Контроль за образованием клонов осуществляют с помощью инвертированного микроскопа. По окончании культивирования проверяют антителообразующую способность клонов иммуноферментным анализом (ИФА).

4. Оформите протокол занятия.