Лабораторная работа № 5

Сложные методы окраски микроорганизмов. Окраска по Граму.

Теоретические пояснения:

Сложные методы окраски имеют дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроорганизма. К сложным методам окраски относятся: окраска по методу Грама, окраска спор и т. д. Все бактерии в зависимости от способности окрашиваться по Граму разделяются на две нетаксономические группы – грамположительные и грамотрицательные формы (Рис.6). Окраска предложена в 1884г. датским ученым Х. Грамом и позволяет дифференцировать бактерии, принадлежащие к различным видам, но сходные по форме и размерам. При обработке мазков микроорганизмов генцианвиолетом, а затем йодом препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни бактерии также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске фуксином обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), т. е. не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий.

Рис.6. Строение клеточной стенки грам (+) микроорганизмов (слева) и грам (-) микроорганизмов (справа)

Различие в окраске объясняется особенностями химического строения бактерий и ультраструктурой клеточных стенок, которые постоянны для определенного вида. Клеточная стенка грамположительных бактерий содержит многослойный муреин со сравнительно часто расположенными сшивками. Белки грамположительных бактерий имеют более кислый характер и лучше окрашиваются основными красителями, чем у грамотрицательных бактерий. Кроме того, грамположительные бактерии содержат рибонуклеат магния, который взаимодействует с образующимся в процессе окраски комплексом и препятствует вымыванию его спиртом. На результат окрашивания оказывают влияние небольшие отклонения в условиях культивирования или в методе окраски, возраст культуры, кислотность среды (в кислой среде, как правило, все бактерии грамотрицательны). При окраске по Граму необходимо точно соблюдать указанные сроки.

Модификацией окраски по Граму является способ Синева, при котором вместо жидкой краски генцианового фиолетового используют полоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные этой краской и высушенные. На фиксированный мазок наносят 2–3 капли воды, на них помещают полоски окрашенной фильтровальной бумаги. Остальные этапы окраски аналогичны классическому методу Грама.

Для определения принадлежности бактерий к таксономической группе

используют также экспресс-метод Грезерсона (1979). На предметном стекле

в капле 3 %-го раствора КОН готовится суспензия изучаемой культуры. При

этом грамположительные бактерии коагулируют, а грамотрицательные образуют вязкую тянущуюся массу.

Цель работы: изучить технику окраски микроорганизмов по Граму

Материалы и оборудование: Предметные и покровные стекла, микробиологические петли, спиртовки, кристаллизатор с подставкой для препаратов, промывалка с водой, микроскопы, 1%-ный водный раствор генцианвиолета или кристаллвиолета, раствор Люголя – 1 г I₂-2 г KI на 300 мл дистиллированной воды склянка с 95%-ным этанолом, 0,1%-ный водный раствор фуксина, чистые суточные культуры микроорганизмов, микроскопы, иммерсионное масло, 3 % раствор КОН.

Ход работы:

1) приготовить на предметном стекле мазок бактериальной культуры, высушить и зафиксировать в пламени спиртовки;

2) окрасить 1 %-м раствором генцианового фиолетового в течение 1 минуты;

3) краситель слить и, не промывая мазки, залить их раствором Люголя на 1–2 минуты;

4) промыть препарат обильно водой;

5) погрузить мазок в стакан с 96 % этиловым спиртом, обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в стакане; обычно для этого требуется 10–30 секунд, в зависимости от толщины мазка;

6) промыть препараты водой (при микроскопировании таких препаратов грамотрицательные бактерии бесцветны);

7) окрасить препараты фуксином течение 1 минуты;

8) препараты высушить и микроскопировать.

Вопросы для самоконтроля:

1. В чем сущность метода окрашивания бактерий по Граму?

2. Почему бактерии окрашиваются по-разному методом Грама?

3. Какие факторы оказывают влияние на результат окрашивания по Граму?

4. Какие существуют модификации метода окрашивания по Граму?

5. Какой компонент клеточной стенки является обязательным для

грамположительных и грамотрицательных бактерий?

6. В чем сущность экспресс-метода Грезерсона?