Характеристика основных белковых фракций и их диагностическое значение

Альбумин. Данный белок, имеющий относительную молекулярную массу 65000 Д, синтезируется в печени. Концентрация альбумина в плазме крови поддерживается на высоком уровне благодаря относительной непроницаемости для этого белка стенок кровеносных сосудов. Этот концентрационный градиент важен для поддержания постоянства объема плазмы крови. Содержание в норме: 3,5 – 5,5 г% (СИ: 33-55 / л). Белок синтезируется в печени. Альбумин не содержит углеводных остатков, образован одной длинной полипептидной цепью с большим количеством дикарбоновых аминокислот, имеет отрицательный заряд. Поэтому удерживает много положительных ионов натрия и создает основную часть осмотического давления крови.

Уникальность его пространственной структуры заключается в том, что он способен формировать высоко и низко специфичные сайты для связывания различных молекул, он обратимо соединяется с билирубином, жирными кислотами, ионами кальция, хлора, лекарственными веществами. Структурно-функциональная изменчивость является источником дополнительных функциональных способностей, в частности возможности формирования буферной антиоксидантно – проксидантной системы.

Определение его концентрации в сыворотке крови является важным диагностическим показателем в лабораторной практике. Снижение концентрации приводит к выраженному нарушению метаболизма. Гипоальбуминемия вызывается следующими факторами:

- ослаблением синтеза альбуминов биоэнергетических процессов, истощением ферментных систем;

- нарушением утилизации белка тканями при одновременном повышении его распада;

- нарушением динамического равновесия белков крови и тканей;

- использованием белка для энергетических целей при нарушении энергетического и углеводного метаболизмов;

- пропотеванием альбуминов в межтканевые пространства в силу повышенной проницаемости клеток эндотелия капиляров;

- потерей белка через почки, раневые и ожоговые поверхности;

- нарушением усвоения белка вследствие поражения желудочно-кишечного тракта.

Лизоцим – белок, секретируется во всех организмах, начиная с вирусов, кончая человеком. Имеется в сыворотке крови человека, в слезах, секретах из носа. Белок с м.м. 14000Д. Действует на пептидогликаны гр+ бпктерий, поэтому называют мурамидазой, т.е.расщепляет основное вещество клеточной стенки – муреин. Гидролизует 1,4 гликозидные связи между N - ацетилмурамовой и N – ацетилглюкозамином. Установлена его третичная структура. Это глобулярный белок из 129 аминокислот, содержит 4 дисульфидных мостика. 30 % это альфа – спираль, 70% - бетта структура. Лизоцим быстро синтезируется, накапливается в лизосомах и поступает в среду в зависимости от различных стимулов. Особенно велика его активность на слизистых оболочках. В сыворотке крови менеее активен из - за самоассоциации в гуморальной среде. Но он придает сыворотке крови 50 % бактерицидность. Лизоцим повышает свертываемость крови, способен связывать биогенные амины и другие БАВ, участвует во многих физиологических процессах, способствует выработке антител.

С – реактивный белок (СРБ) - свое название получил за способность вступать в реакцию преципитации с С – полисахаридом пневмококков. В сыворотке крови здоровых людей его мало – до 5 мг/ мл. Обнаруживается при многих заболеваниях, которые сопровождаются воспалением, некрозом тканей, он самый чувствительный маркер, увеличивается в 20 – 100 раз и до 1000 в первые 6 – 8 часов. Имеет важное диагностическое значение при ревматизме, инфаркте миокарда и является в этом случае более чувствительным тестом, чем РОЭ, лейкоцитоз.

СРБ может находиться в виде пентапексина, имея в составе 5 одинаковых негликозилированных субъединиц, нековалентно связанных друг с другом с м.м. 100 000 Д, а также в виде нео СРБ. Пентамер СРБ переходит в мономер – нео СРБ, который индуцирует воспалительный процесс. Он является мультифункциональным белком острой фазы, играет решающую роль при воспалении, в защите от чужеродных антигенов, в аутоиммунных процессах: он связывается с бактериальными полисахаридами, гликолипидами и это ведет к активации по классическому пути системы комплемента, участвует в регуляции функции иммунокомпетентных клеток. СРБ активирует моноциты, регулирует функцию нейтрофилов, усиливает фагоцитоз, индуцирует хемотаксис и выработку супероксидазы.

Гаптоглобин (Нр) – гликопротеид, образует прочный комплекс с гемоглобином и таким образом предохраняет организм от потери железа. Нр составляет 1,2 – 1,4 % общего количества протеинов сыворотки. Доказано 2 типа гаптоглобина: Нр 1- 1 с м.м. 85 тыс Д, константой седиментации 4,5 S и Нр 11 с м.м. 165 тыс. Д, константой седиментации 7 S. Тип Нр 1-1 у гомозигот, химически однороден, он способен связывать одну молекулу гемоглобина (Нb), а Нр 2 – 2 гомозиготный и Нр 2-1 гетерозиготный связывают по 2 молекулы гемоглобина. Молекулярный вес комплекса Нр. Hb 1-1 155 тыс Д, а вес комплексов Нр. Нb 2-2 и Нр.Нb 2-1 по 310- тыс Д. Наследование Нр зависит от 2 –х аутосомных генов Нр 1 и Нр 2, которые образуют белки из 2- х типов пептидных цепей: а и В- цепи. В- цепь обладает одинаковой для всех фенотипов подвижностью, а-цепь меняющаяся в зависимости от типа Нр: а1 –цепь обладает высокой подвижностью, а2 –медленной. У гомозигот Нр 1-1 – только а 1 цепь, Нр 2-2 только а2 цепь, а у гетерозигот Нр 1-2 есть и а1 и а2 цепи в равном соотношении. Типы передаются по наследству, поэтому фенотипирование используют в судебно-медицинской практике.

Гаптоглобин является реактантом острой фазы, неспецифически увеличивается его содержание на различные патологические стимулы. Он комплексируется со многими веществами, которые образуются при распаде клеток, является естественным ингибитором катепсина В. Комплекс Нр.Нb является пероксидазой, вместе с церулоплазмином тормозит перекисное окисление.

Церулоплазмин (Ср) -медьсодержащий гликопротеид плазмы крови, обладает четвертичной структурой, состоит из 8 субъединиц. В Ср входит 6-7 ионов меди, это 95% всей меди организма, Ср ее транспортирует и медь играет существенную роль в образовании четвертичной структуры. В формировании активного центра. Выявлен генетический полиморфизм Ср. Основным источником синтеза Ср является печень, но и некоторые ткани также способны его вырабатывать: лимфоциты, клетки селезенки, ткани мозга, бронхов. Синтезируется Ср геном протяженностью в 65 кб, он находится в 3 хромосоме, содержит 20 экзонов.

Функции Ср многообразны:

- является ферроксидазой – окисляет 2-х валентное железо до 3-х валентного, которое встраивается в трансферрин. Трансферрин транспортирует железо в костный мозг, где происходит синтез гема. Таким образом Ср способствует кроветворению феррооксидазной активностью;

- обладает антиоксидантным действием, он усиливая связывание окисленных ионов железа с трансферрином – исключает их из реакции перекисного окисления, Ср удаляет радиотоксины, сохраняет систему кроветврорения и таким образом повышает выживаемость организма;

- Ср значительно увеличивается в сыворотке крови при различных инфекционных заболеваниях, оказывает противовоспалительное действие;

- Ср регулирует уровень биогенных аминов в организме, участвует в метаболизме биогенных аминов – медиаторов нервной системы, регулирует уровень норадреналина, адреналина, серотонина.

Трансферрин (Тf) – железосодержащий гликопротеид с м.м. 76-80 кДа. Молекула скручена и имеет 2 глобулярных домена, в каждом имеется сайт для связывания железа. Комплекс метталл-белок устойчив. Синтез осуществляется с гена трансферрина, который находится в 3 хромосоме, синтезируется в гепатоцитах. Трансферрин получает жнлезо от гемоглобина. Старые эритроциты захватываются макрофагами, которые освобождают железо из протопорфиринового кольца путем действия гемоксикиназы и отдают его трансферрину.

Трансферрин находится при электрофорезе в В – глобулиновой фракции, встречается в 3-х и более генетических состояниях. Комплекс трансферрина с железом окрашивается в оранжевый цвет, здесь железо находится в 3-х валентной форме. Концентрация у здоровых людей от 200 до 400 мг%. Выявлено 19 типов Тf, различающихся по величине заряда белков молекулы, аминокислотному составу и числу молекул сиаловых кислот. Типы связаны с наследственными особенностями. В норме Тf насыщен железом на 1/ 3, дополнительное количество железа, которое может связаться с трансферрином, составляет ненасыщенную (латентную) железосвязывающую способность сыворотки крови.

В плазме здорового человека трансферрин может находиться в 4-х молекулярных формах: 1. Апотрансферрин- не связанный с железом; 2. Моножелезистый трансферрин С – железо занимает один сайт для связывания в С терминальном домене. 3. Моножелезистый трансферрин N – железо только в N сайте. 4. Дижелезистый трансферрин – железо в С и N доменах.

Сывороточный трансферрин является источником железа для всех клеток тела. Для поступления железа в клетки есть специальные механизмы – рецептор трансферриновый, он состоит из 2-х доменов с м.м. 180 кДа. На каждом домене возможно связывание 2-х молекул трансферрина. Уровень экспрессии рецептора отражает потребности клетки в поглощении железа, которые определяются скоростью клеточного деления. При присоединении трансферрина к рецептору комплекс подвергается эндоцитозу и железо освобождается от трансферрина при низком рН. Затем железо через эндосомальную мембрану транспортируется во внутриклеточный пул железа, а комплекс апотрансферрин - рецептор с помощью анутриклеточных везикул возвращается на наружную поверхность клетки. Рецептор остается включенным в мембрану, а апотрансферрин освобождается в окружающую среду.

Повышение уровня трансферрина наблюдается при дефиците железа, оно может предшествовать развитию анемии Понижение уровня трансферрина отмечается при многих хронических процессах, при циррозе печени, потери белка при ожогах, нефротическом синдроме и гастроэнтеритах, злокачественных опухолях.

Гемоглобин – в своем составе тоже содержит железо, составляет молекулярную основу дыхательной функции крови, транспортирует кислород и углекислый газ. Молекулярный вес равен 66 кДа, форма молекулы шарообразная. В воде гемоглобин хорошо растворяется. Гемоглобин состоит из белка глобина и гемма (ферропротопорфирина) нековалентно связанных между собой. Гемм представляет плоскую молекулу, в которой ион железа в центре ядра протопорфирина. Белок гемоглобина – глобин состоит из 2-х альфа и 2-х В- цепей, т.е. составляет тетрамер внутри полость, в нее обращены неполярные группы аминокислот. Они защищают молекулу изнутри от контакта с водой и стабилизируют молекулу в целом. Уровень гемоглобина в норме составляет 132-164 г/л, повышается при гипоксии, при хронической легочной недостаточности. Врожденных пороках сердца, при потери жижкости организмом, при отравлении угпрным газом. Снижается при расстройстве всасывательной способности железа, при острых кровотечениях, при гемолизе, остомиеломах, фиброзе, остеобластах, раке, поражениях почек.

Миоглобин – хромпоротеид, содержащийся в миокарде и скелетной мускулатуре, поэтому увеличивается его содержание в крови при инфаркте миокарда и при повреждении мышц. Значение его определения имеет в первые часы инфаркта миокарда (ИФМ), особенно при атипическом течении, в этом случае увеличение миоглобина происходит через 2-3 часа у 92 % больных, через 5 часов у 100%. Снижение концентрации происходит по разным типам, что имеет прогностическое значение. 1 тип – литический – характеризуется одним пиком повышения концентрации с постепенным снижением к 16-36 часам. Он характерен для неосложненного течения ИФМ. Тип 11 – гектический протекает в форме скачкообраазных изменнений от высоких цифр до нормы в первые 24 часа. Тип 111 –постоянный характеризуется постоянным высоким содержанием миоглобина с небольшими колебаниями. Наблюдается при осложненном тромбоэндокардитом ИФМ.

Компоненты системы комплемента – это не один белок, а сложная система белков, включающая около 20 взаимодействующих компонентов: С1, С2, С3.....С9, фактор В, фактор D и ряд регуляторных белков. Все эти компоненты – растворимые белки с м.м. от 24000 до 400 000Д, циркулирующие в крови и тканевой жидкости. Большинство из них не активны до тех пор, пока не будут приведены в действие или в результате иммунного ответа (с участием антител), или непосредственно внедрившимся микроорганизмом.

Один из возможных результатов активации комплемента - последовательное объединение так называемых поздних компонентов (С5, С6, С6, С7, С8 и С9) в большой белковый комплекс. Вызывающий лизис клеток (литический, или мембранатакующий, комплекс). Агрегация поздних компонентов происходит в результате ряда последовательных реакций протеолитической активации с участием ранних компонентов (С1, С2, С3, С4, фактора в и фактора D). Большинство этих ранних компонентов – проферменты. Последовательно активируемые путем протеолиза. Когда какой-либо из этих проферментов расщепляется, он становится активным протеолитическим ферментом и расщепляет следующий профермент, и т.д. Так как многие из активированных компонентов прочно связываются с мембранами, большинство этих событий происходит на поверхности клеток.

Центральный компонент этого протеолитического каскада С3 компонент. Его активация путем расщепления представляет собой главную реакцию всей цепи системы комплемента. Он может быть активирован классическим и альтернативным путем. В обоих случаях С3 расщепляется С3 конвертазой. Два разных пути приводят к образованию разных С3 конвертаз. С3 конвертаза расщепляет С3 на 2 фрагмента – большой С3b и С3а. С3b – связывается с мембраной клетки мишени и с С3 конвертазой. В результате образуется большой ферментный комплекс с измененной специфичностью - С 5 конвертаза. Затем С5 конвертаза расщепляет С5 и тем самым инициирует сборку литического комплекса из поздних компонентов от С5 до С 9. Каждый активированный фермент расщепляет много молекул следующего профермента. Каскад активации ранних компонентов действует как усилитель: каждая молекула активированная в начале всей цепи, приводит к образованию множества литических компонентов.

Функции белков системы комплемента: 1. Опсонизирующая – т.е.присоединение к м.о. различных молекул, которые являются лигандами и к ним присоединяются мононуклеарные клетки с определенными рецепторами- все это усиливает фагоцитоз. 2. Участие в воспалительных реакциях, активация системы комплемента приводит к выделению из тканевых базофилов БАВ, которые стимулируют воспалительную реакцию. 3. С3а способен вызывать миграцию нейтрофилов к месту воспаления, индуцировать их прикрепление к эндотелию сосудов, вызывать в них развитие респираторного взрыва и дегрануляцию. 4. С5а содействует хемотаксису, агрегации и дегрануляции нейтрофилов и образованию свободных радикалов кислорода. 5. Цитотоксическая или литическая функция. В конечой стадии активации комплемента образуется мембраноатакующий комплекс (МАК), который атакует мембрану бактериальной клетки и разрушает ее.

Альфа 2 – макроглобулин – ингибитор протеаз, регулирует активность различных протеолитических ферментов (Каждая субъединица имеет по две полипептидные цепитрипсин, химотрипсин, тромбин, калликреин, плазмин). Альфа макроглобулин существенно отличается от других белков сыворотки крови. Это гликопротеид м.м. 716000 – 725 000Д, состоит из 2-х субъединиц нековалентно связанных. В молекуле имеется кальций и магний. Альфа2 макроглобулин устойчив к действию температуры, чувствителен к кислым реакциям среды. При температуре 40 градусов С активность сохраняется. Синтезируется в печени, присутствует в сыворотке крови, во внеклеточной, синовиальной, амниотической, спинномозговой, лимфатической жидкости. Потеря этого белка приводит к летальному исходу.

На долю альфа 2 макроглобулина приходится до 12% ингибиторной активности крови. Образование комплекса между ферментом и ингибитором – это сложная многоступенчатая реакция. На первом этапе активная протеаза реагирует с альфа 2 макроглобулином, образуется непрочная связь, на 11 этапе фермент расщепляет пептидную связь и это приводит к конформационному изменению альфа 2 макроглобулина, а на 111 этапе протеаза ковалентно присоединяется к особому участку в молекуле альфа 2 макроглобулина. Это приводит к образованию компактной структуры, к фактическому захвату протеазы и ее блокированию, т.е. как бы альфа макроглобулин ловит в свою ловушку фермент и лишает протеазы протеолитической активности, поэтому его называют рестриктор протеаз, а не ингибитор.

Альфа 2 макроглобулин влияет на способность макрофагов и нейтрофилов мигрировать в участки воспаления и на синтез различных медиаторов. Ингибирует активность естественных клеток киллеров. Альфа 2 макроглобулин способен связываться с мембранами клеток РЭС, лимфоцитами, макрофагами. Белок изменяет реакции лимфоцитов на чужеродные антигены, лимфокины. Имея широкую специфичность в отношении различных протеаз, выполняет защитные функции, инактивируя большинство протеаз, которые при патологии накапливаются. Он может образовывает защитный барьер против патогенных микроорганизмов и паразитов, которые выделяют протеолитические ферменты.

Уровень альфа 2 макроглобулина снижается при вирусном гепатите, на ранних стадиях ожоговой болезни. Увеличение отмечается при нефротическом синдроме, у больных сахарным диабетом. Особая роль белка имеется при злокачественных опухолях. При далеко зашедшем процессе снижается его уровень в 2- 5 раз на фоне повышения массы опухоли.

Фибриноген – гликопротеин с м.м. 340000Д, состоит из 3-х тысяч аминокислот, имеет 2 димера в каждом 3 полипептидных цепи. Фибриноген вырабатывается паренхимными клетками печени и поступает в кровь. Фибриноген под влиянием тромбина превращается в фибрин по типу протеолитического дробления молекулы. Сначала тромбин отщепляет от молекулы фибриногена 2 пептида А, образуя неполноценные мономеры фибрина – дез А мономеры. Затем отщепляются 2 пептида В. Возникают А-В мономеры или полные мономеры фибрина.

Фибринопептиды А иногда появляются в крови – это говорит о внутрисосудистом свертывании крови. Оставшаяся молекула фибриногена – фибрин – мономер приобретает способность соединяться с себе подобными и образовывать фибрин - полимер, который представляет гель. Сборка мономеров проходит этапы формирования димеров, которые в продольном и поперечном сшивании образуются полимеры фибрина – протофибриллы, а затем нити фибрина. Тромб из такого фибрина легко растворяется фибринолизином и он не может обеспечить полноценный гомеостаз. Это бывает причиной кровоточивости и плохого заживления ран.

2.4. Определение некоторых индивидуальных белков сыворотки крови

2.4.1. Определение гаптоглобина

Принцип метода: сывороточный гаптоглобин образует с раствором гемоглобина комплекс, осаждаемый риванолом. По уровню оставшегося в растворе гемоглобина фотометрически определяют содержание гаптоглобина в сыворотке крови.

Реактивы:

1. Риванол. К 100 мг риванола добавить 15 мл дистиллированной воды, встряхнуть до полного растворения.

2. Гемоглобин. К 100 мг гемоглобина добавить 10 мл дистиллированной воды, встряхнуть и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин для удаления агрегатов.

3. раствор сульфата аммония 10 %.

Ход определения: Для проведения исследования необходимо поставить 3 пробы: опытную, контрольную и стандартную.

В опытную пробу вносят 0,3 мл дистиллированной воды, 0,5 мл негемолизированной сыворотки, 0,2 мл раствора гемоглобина и перемешивают.

В контрольную пробу вносят 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл сыворотки крови и перемешивают. Обе пробы инкубируют 10 минут при комнатной температуре, после чего добавляют по 3 мл раствора риванола.

В стандартную пробу вносят 2,8 мл дистиллированной воды и 0,2 мл гемоглобина, перемешивают. Через 5 минут все три пробы центрифугируют при 3000 об/ мин в течение 6-7 минут. К надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 10 %-ного раствора сульфата аммония и инкубируют 60 минут при комнатной температуре.

Далее измеряют оптическую плотность опытной, контрольной и стандартной проб по отношению к дистиллированной воде в кюветах с толщиной слоя жидкости 5 мл на ФЭК (зеленый светофильтр, № 6)

Оценка результата; расчет ведут по формуле:

Х = ((Ес - (Ео - Ек) х2) / Ес, ЭТО надо исправить

где Х - концентрация гаптоглобина г/л; Ес, Ео, Ек – оптическая плотность стандартной, опытной, контрольной проб.

Содержание гаптоглобина в сыворотке крови составляет 0,4-1,8 г/ л.